如何檢測埃博拉病毒？

據媒體報道，深圳華大基因聯合軍事醫學科學院微生物流行病研究所成功研制了埃博拉病毒核酸檢測試劑，且已經向國家食品藥品監管總局申請了應急審批。1

倘若審批通過，盡快進入臨床應用，将能極大地增強我國對埃博拉病毒的應對能力。目前，常用的病毒感染的檢查方法包括病毒的分離鑒定、病毒的血清學診斷、病毒成分(蛋白抗原和核酸)的檢測。

标本的采集與送檢

用于分離病毒或檢測病毒及其核酸的标本應采集病人急性期标本。根據不同病毒感染采取不同部位的标本(如鼻咽分泌物、腦脊液、糞便或血液)。并且注意使用抗生素以抑制标本中的細菌或真菌等生長繁殖。由于病毒在室溫中很易被滅活，應在采集和運送标本中注意冷藏。

血清學診斷标本的采取，應在發病初期和病後2~3周内各取一份血清，以利于動态觀察雙份血清抗體效價。

病毒的分離與鑒定

由于病毒具有嚴格的細胞内寄生性，故應根據病毒的種類選用相應的細胞組織、雞胚或敏感動物進行病毒的分離與鑒定，這是病毒病原學診斷的金标準。但方法複雜、要求嚴格切需要較長時間，故不适合臨床診斷，隻适用于病毒的實驗室研究或流行病學調查。

動物接種是最早的病毒分離方法，目前用的不多。可根據病毒的親嗜性選擇敏感動物極其适應的接種部位，觀察動物的發病情況、進行血清學檢測等。該方法簡便，實驗結果易于觀察，對某些上午民反的細胞進行培養的病毒，該方法仍在沿用。但動物對許多人類病毒不敏感，或感染後症狀不明顯，而且動物體内常帶有潛在病毒，應防止将這些潛在病毒誤作接種的病原體。

雞胚對多種病毒敏感，通常選用孵化9~14天的雞胚。因為雞胚對流感病毒最敏感，故目前除分離流感病毒還繼續選用外，其他病毒的分離基本已被細胞培養所取代。

細胞培養法為病毒分離鑒定中最常用的方法。可根據細胞生長的方式分為單層細胞培養和懸浮細胞培養。從細胞的來源。染色體特征及傳代次數又可分為原代細胞、二倍體細胞、傳代細胞系等。

病毒的形态學鑒定，即通過電子顯微鏡和免疫顯微鏡進行形态觀察和大小的測定。

病毒的血清學鑒定，即通過已知抗體對病毒進行種、型和亞型的血清學鑒定，方法除常用的免疫标記法外，還有血凝抑制試驗等。

病毒的分子生物學鑒定，主要方法包括核酸擴增、核酸雜交、基因晶片、基因測序等分子生物學技術。

對于一些血清型别不多的病毒或在尋常細胞培養系統中還不能成功增殖的病毒，直接檢測抗原是快速而實用的方法。這一方法要求标本中有一定量的抗原和具備高品質的抗體;其原則為免疫學技術，即用特異标記的抗體檢測相應的抗原。可以用免疫熒光或免疫酶标記抗體檢測在病毒感染局部脫落細胞或分泌物細胞中的抗原，也可用酶聯免疫測定法(elisa)或乳膠凝集法檢測抗原。這一方法在數小時或一天内可獲得結果。

用特異的抗原可以檢測病毒感染者血清中的igm抗體，以快速診斷病原體。應用的病毒抗原或是利用基因工程表達的重組抗原，也可以是用根據編碼基因片段推導的合成肽作為抗原。由于igm抗體出現于病毒感染早期，标本采集的時間對這一方法的檢測結果影響很大。此外，所用抗原的品質與覆寫抗原表位的幅度也會影響檢測結果。還可将病毒蛋白先經凝膠電泳，再轉移至膜上，用血清标本與之作用後染色的方法(稱western印迹法、免疫印迹法或蛋白印迹法)檢測血清中針對某種病毒抗原亞機關的抗體。

由于多數病毒基因均已成功地被克隆及進行了核苷酸序列測定，是以可以利用病毒基因作為探針，用核酸雜交的方法檢測标本中有無相應的病毒核酸。作為探針的病毒核酸可以用同位素或非放射性核素标記。用探針雜交後，為檢測核酸雜交體，可用放射自顯影法或用生物素-親和素系統進行檢測。這一方法的敏感性一般并不高，但對标本中含有病毒核酸量較多時則很實用。用凝膠電泳将标本中dna電泳後，轉移至膜上(southen印迹法)，再用病毒探針作核酸雜交，可根據分子量大小分辨标本中病毒核酸存在的狀态，例如是整合型還是遊離型。

對于已測定基因核苷酸序列的病毒，可設計相應的病毒基因的引物，作多聚酶鍊反應(pcr)。其原則為先加入标本中提取的核酸(根據待測病毒為rna病毒或dna病毒而加入rna或dna)，對rna則需先轉錄成互補的dna，加入耐熱的dna多聚酶後，在一定溫度及條件下作pcr。通過擴增病毒基因片段可診斷标本中是否存在病毒核酸。本法十分敏感，但需注意操作時污染而出現的假陽性。

檢測病毒核酸的缺點為，病毒核酸陽性并不等于标本中存在有感染性的活病毒。此外，對于未知病毒及可能出現的新病毒則因不了解病毒核苷酸序列不能采用這些方法。

由于病毒的細胞培養周期長，而且埃博拉病毒分離需在bsl一4實驗室進行，我國目前還沒有符合此生物安全等級的實驗室;血清學方法敏感性低;分子生物學方法有rt—pcr、實時熒光rt—pcr、巢式pcr、環介導等溫擴增技術等。2

據悉，本次送審檢測試劑，正是應用了分子生物學方法。關于具體的檢測流程，首先研究人員強調對于可疑的病人樣本(血液等體液)要在生物安全3級及以上的實驗室完成核酸的提取，或者60度滅活1小時後提取核酸用于檢測，試劑是通過熒光聚合酶鍊反應(pcr)技術，整個檢測時間大約需要3~4個小時。

參考文獻

1. 果殼網，中國研制的埃博拉檢測試劑申請緊急審批，2014.8.14，http://www.guokr.com/article/438996/

2. 夏文英，鄭夔，黃吉城等，埃博拉病毒檢測基因晶片的制備初探[j]，中國國境衛生檢疫雜志，2011，34(3)：150-154