1欣谕凍幹前言
欣谕冷凍幹燥廣泛用于制備治療性蛋白質制劑，蛋白凍幹制劑可以提供更好的保存期限，友善藥物的儲藏和運輸，然而，蛋白在凍幹過程中存在許多應力，包括低溫應力、當機應力(枝狀冰晶的形成、離子強度的增加、pH值的改變、相分離等)、幹燥應力(失去蛋白質表面水分子)等，這些應力常常直接或間接導緻蛋白質類藥物失去天然構象進而變性或失活。是以即使采用了冷凍幹燥這種溫和的幹燥方式，還需要加入合适的凍幹保護劑以很好的保護蛋白穩定性。
冷凍幹燥保護劑對于蛋白質的保護原理已經被研究讨論了幾十年，形成了一些被普遍接受的共識。如在當機階段，最主要的假說為“優先化作用”;在幹燥階段最主要的有2種假說，即“玻璃化”和“水置換”。
冷凍幹燥保護劑的分類方式很多，有文獻中提出了一個公式化模型，按照功能把冷凍幹燥保護劑分類，包括5類: ①pH緩沖劑，如Tris、組氨酸、枸橼酸等;②配體，可以優化蛋白質的熱力學穩定性;③穩定劑，一般是雙糖，如蔗糖、海藻糖等，可通過抑制蛋白質的展開和提供玻璃基質起保護作用;④非離子表面活性劑，可減少蛋白質的聚集;⑤填充劑，如甘露醇、甘氨酸、羟乙基澱粉、血清白蛋白等，可提高産品的實體成型性。這裡我們簡要介紹其中幾種。
2緩沖鹽
首先，蛋白質穩定性受環境pH的影響，緩沖液選擇在蛋白質制劑的開發過程中是最關鍵的，并且必須在配制階段建立。在選擇緩沖液pH時，建議pH不要太接近蛋白質的pI(等電點)以避免聚集。
磷酸鹽是蛋白質配方中最常見的緩沖劑之一，特别是含水蛋白質藥物，有效pH值範圍為5.8-8.0，并且具有生物相容性。然而，正如“冷凍過程中的pH變化”所讨論的那樣，磷酸鹽緩沖液，特别是磷酸氫二鈉，在冷凍過程中會發生顯着的pH變化，是以不推薦用于pH敏感蛋白質。相反，磷酸鉀，組氨酸，三羟甲基氨基甲烷(Tris)和檸檬酸鹽緩沖液在冷凍期間顯示出最小的pH變化。此外，低緩沖液濃度可有助于降低pH變化。組氨酸是一種氨基酸，有效pH範圍為5.5-7.4，它與生物pH相容，并且經常用于冷凍幹燥的蛋白質。然而，選擇适當的冷凍幹燥水性制劑，包括緩沖劑，取決于蛋白質的要求及其給藥途徑。是以，需要許多研究和各種生物實體方法來篩選出幾種緩沖液的濃度清單。
3填充劑
為了保證冷凍幹燥後形成良好的配方結構防止産品塌陷，同時改善配方溶解性，冷凍幹燥保護劑中還需要加入填充劑。首先，填充劑在複溶時應該是充分可溶的并且與制劑中的蛋白質藥物相容。此外，它們沒有毒性問題并且具有高共晶/共熔溫度(Teu)，可有效提高冷凍幹燥效率。
甘氨酸和甘露醇經常用作凍幹蛋白質制劑的填充劑。甘氨酸在用作填充劑時具有優勢，因為它是無毒的。它具有高共晶/共熔溫度(Teu)，可實作高效冷凍幹燥和高溶解度。
甘露醇具有與甘氨酸相同的優點，并且對特定蛋白質藥物如LDH和轉化生長因子-b1具有穩定作用，其穩定效果取決于其濃度。是以，在選擇填充劑時，應仔細考慮穩定效果以及粉餅外觀。大多數氨基酸容易結晶并且可以潛在地用作填充劑以穩定蛋白質，然而，酸鹽的形成阻礙了它們的結晶。 NaCl是另一種結晶劑，但其共熔溫度(Teu)相對于其他填充劑的而言太低，是以不推薦使用。
對于填充劑，應考慮退火步驟。甘氨酸和甘露糖醇在冷凍幹燥過程中應以結晶形式存在。 但是在冷凍步驟期間，過冷卻誘導兩種填充劑以無定形形态當機，容易導緻粉餅塌陷。另外，在沒有退火的情況下，填充劑可以在初級幹燥期間重結晶造成西林瓶破裂，特别是當制劑中包含高濃度的甘露醇時。填充劑應在非晶相的玻璃化轉變溫度(Tg’)和填充劑的共熔溫度(Teu)之間進行有效結晶，而退火時間取決于填充劑濃度及其性質。 對于甘露醇和甘氨酸，填充高度在1cm時，推薦在-20或-25℃和2小時。
4糖類
糖類是凍幹蛋白質制劑中最常用的賦形劑，因為它們的結構中具有許多羟基，是以可以通過取代蛋白質和水之間的氫鍵來提供穩定效果。此外，大多數糖在正常冷凍幹燥條件下不結晶，導緻凍幹蛋白質制劑更快速複溶。還原性糖通常不用于冷凍幹燥，因為它們通過美拉德反應與蛋白質反應，然而，當它們的穩定性效果優于其他賦形劑時，它們可以使用。蔗糖已廣泛用于蛋白質制劑配方，海藻糖被認為是比蔗糖更優異的凍幹保護劑，因為它具有更高的玻璃化轉變溫度(Tg’)。海藻糖還具有其他優點，例如低吸濕性，不存在内部氫鍵，進而與蛋白質的氫鍵更靈活，化學反應性低。蔗糖和海藻糖的高粘度也可降低在高于玻璃化轉變溫度(Tg’)的溫度下幹燥期間的蛋白質變性速率，進而提高冷凍幹燥效率。
5其他
多元醇廣泛用于蛋白質穩定劑，因為它們可以通過其羟基穩定蛋白質。多元醇已被用作冷凍保護劑和凍幹保護劑。例如，在凍融期間，LDH在不同程度上受甘油，木糖醇，山梨糖醇和甘露醇的保護。
聚合物已被用作蛋白質溶液和凍幹制劑的保護劑。血清白蛋白是用于蛋白質藥物開發的最廣泛使用的聚合物之一，作為凍幹保護劑和冷凍保護劑。許多上市蛋白質藥物含有不同量的白蛋白(表1)。但是，血清白蛋白具有與血源性病原體相關的潛在污染物，限制了其在蛋白質藥物制劑中的使用。是以，建議rHA替代血清白蛋白。最終，建議在沒有白蛋白的情況下開發蛋白質藥物。
在冷凍步驟中，形成冰水界面可能導緻蛋白質表面變性。表面活性劑降低蛋白質溶液的表面張力，保護其免受表面變性。最廣泛使用的表面活性劑之一是Tween 80。
6小結
已經有超過50%的蛋白質藥物産品選擇冷凍幹燥，因為在固态下，蛋白質藥物的實體和化學降解減少，進而保證了其長期穩定性。不同結構和性質的
冷凍幹燥保護劑對冷凍幹燥的不同階段保護蛋白質的保護機制不同， 聯合使用時對某些蛋白質有協同保護作用，是以，了解常用凍保護劑種類和性質對于開發更有效的蛋白制制劑至關重要的。