1927年4月18日上午,國民政府在南京舉行定都典禮。由于南京國民政府成立倉促,當時還未來得及刻制國玺,隻镌刻了一方“中華民國國民政府”印,由監察委員蔡元培代表國民黨授印,胡漢民代表國民政府受印。
1928年10月,蔣介石當選為中華民國國民政府主席兼陸海空軍總司令。登上中國最高權力寶座的蔣介石,急需要一顆新的國玺來替換中華民國國民政府印。在他的授意下,11月2日,國民政府國務會議議決:制玉質國玺,文曰“中華民國之玺”。後來又規定了國玺的尺寸、形狀。由于一時缺乏荊山之玉,隻好留待日後制作。
蔣桂戰争爆發後,陳濟棠公開支援蔣介石,蔣介石遂委陳濟棠為廣東特派員,将兩廣大權交給了陳;令其“随即返粵,不必入京”。陳濟棠受寵若驚,對蔣介石的知遇之恩感激涕零,但不知道該怎樣回報蔣介石。于是他專門咨詢古應芬。古應芬告訴陳濟棠：蔣介石亟需一顆國玺，但沒有合适的印材。
陳濟棠立即派人去緬甸，終于尋到一塊上好的青翠玉石，以9500元大洋的高價将其購回，并托國民政府文官長古應芬帶到南京，獻給蔣介石。蔣介石請玉石專家鑒定，果然是塊稀世珍寶，決定以此制成國玺，遂将這塊緬甸玉石交給印鑄局局長周仲良，讓其負責刻玺工程。
周仲良專門組織了一套人馬，自己親自督制，王褆負責監工并篆文。王褆是民國時期著名的書法家，西泠印社的創辦者之一，凡鐘鼎、籀書、隸書、楷書無所不精，尤通曉治印。民國初年，王褆曾在北京政府印鑄局任技正，袁世凱的“中華民國之玺”六個篆字，就出自他的手筆。
此次，王褆使出渾身本領，書寫了“中華民國之玺”幾個字，與北京政府的玉玺篆字風格有異，更見功力。刻玺工程從1929年7月1日開始，到10月9日國慶前一日琢刻完竣，成為向雙十節獻的一份大禮。南京國民政府的這枚國玺，比北京民國政府的國玺略有擴大，為13厘米，更顯厚實莊重，主要用于國内及外交事務檔案的簽署。
國玺是表示國家最高權力的信印。此外，還有一枚羊脂玉打造的“榮典之玺”應該算不上嚴格意義上的“國玺”，它是由新疆省政府1930年7月采獻，1931年元旦蔣介石親自受呈，并于同年7月1日啟用，為國家元首頒發勳章褒獎令之用。1948年5月20日，蔣介石就職總統後，特由典玺官專司儲存這兩枚印玺。
1949年4月23日，李宗仁帶着中華民國之玺逃離南京後，輾轉去了廣州，後去了重慶。蔣介石欲利用桂系的力量上台，請白崇禧說服李宗仁共推蔣介石重新出山，遭到李宗仁拒絕。但是後來那兩枚印玺還是被蔣介石帶到了台灣。