玉米作為大陸主要糧食和飼料來源，其産量對農業和畜牧業至關重要。提高玉米機關面積産量，特别是單穗粒數，是保障大陸玉米供需平衡的關鍵。關鍵基因的時空特異性表達決定了玉米雌穗的發育，進而影響了玉米單穗産量。然而，正常的植物轉錄組技術往往忽略了細胞的異質性，無法擷取關鍵基因的時空表達資訊。另外，我們對于哪些細胞參類型與了玉米雌穗的形态建成仍然知之甚少。是以，目前以正向遺傳學手段挖掘調控雌穗發育的相關基因，并将其應用于玉米穗部性狀改良中的效率相對較低。2024年5月14日，Nature Plants線上發表了華中農業大學聯合深圳華大研究院共同合作的文章，該研究建構了首個玉米雌穗空間轉錄組圖譜，最終共獲得了12種細胞類型的轉錄組及其空間位置資訊，鑒定并驗證了4種全新的細胞類型。利用空間組學的優勢，鑒定到了兩個在小花分生組織頂端中特異性表達，并決定其分化确定性的MADS-box基因。通過整合單細胞轉錄組及空間轉錄組資料，研究人員探索了一種高通量基因挖掘的新方法，通過建構細胞特異性的基因共表達網絡鑒定了一批潛在控制玉米雌穗建成的新基因。研究人員首先優化了Stereo-seq的實驗條件，開發了适用于玉米雌穗的空間轉錄組測序方法，并選取了處于關鍵生長發育期下的6mm雌穗作為實驗對象，對其分别進行空間轉錄組與單細胞轉錄組測序。在分析了空間轉錄組資料後，研究人員得到了12種細胞類型的轉錄組以及空間位置。參考已有研究中對玉米雌穗解剖學結構的描述，可以快速定義細胞群身份。最終，研究人員發現大部分細胞類型都位于已知的雌穗發育器官内，但同時也鑒定到了四種全新的細胞類型，包括三種分布在花序分生組織中的細胞和一種分布在小花分生組織中心的細胞。為了進一步驗證空間轉錄圖譜的可靠性，研究人員随機選取了在空間轉錄組資料中鑒定到的和已發表的具有空間表達特異性特征的标記基因(55個)，利用原位雜交實驗驗證其表達模式。實驗結果表明，74%的基因在原位雜交中呈現的表達部位與空間轉錄組結果一緻，說明了空間轉錄組測序的可行性和可靠性 (圖1)。
圖1 建構玉米6mm雌穗的空間轉錄組圖譜
基于Stereo-seq技術建構的6mm雌穗的空間轉錄組圖譜能夠清楚區分不同類型的分生組織。是以，根據它們各自不同的空間位置，研究人員提取了6mm雌穗的花序分生組織以及小花分生組織轉錄組，并進行重聚類分析。結果表明，這些分生組織可以被進一步區分為三種不同的細胞類型，分别分布在花序分生組織頂端、小花分生組織外圍和小花分生組織頂端。通過檢測了在三種細胞類型之間存在的一系列差異表達基因，其中包括兩個MADS-box基因，ZmMADS8及其同源基因ZmMADS14，這兩個MADS-box基因在DMT中特異性表達，其表達模式通過mRNA原位雜交得到了驗證。先前的研究表明，MADS-box家族基因在植物器官發育中發揮了重要作用。是以，為驗證ZmMADS8與ZmMADS14的功能，研究人員通過CRISPR/Cas9基因編輯技術産生了ZmMADS8和ZmMADS14的雙基因敲除突變體。觀察發現，在ZmMADS8和ZmMADS14的單突變體中，小花分生組織均可發育正常，能夠産生正常的上位小花。而在CR-Zmmads8/14雙突變體中，小花分生組織不會向下一級花器官分化，而是會逆轉為不确定性長分枝，無法産生正常的花器官(圖2)。這說明ZmMADS8和ZmMADS14是小花分生組織命運決定的關鍵因子。這些結果表明，基于Stereo-seq技術獲得的玉米雌穗空間轉錄組資料能夠區分高度相似的分生組織類型，使我們能夠進一步研究分生組織在分化過程中産生的細微變化，并有助于鑒定關鍵的發育調控因子。
圖2. 利用Stereo-seq資料鑒定到ZmMADS8和ZmMADS14決定小花分生組織确定性
接下來，研究人員利用STRIDE分析流程，将單細胞轉錄組與空間轉錄組資料進行了整合，通過空間映射，注釋了單細胞轉錄組資料中的6種細胞類型，并根據不同細胞的轉錄組資訊建構了具有空間表達特異性的基因調控網絡。其中，研究人員在玉米雌穗分生組織的表皮細胞中鑒定到了以OCL5(OUTER CELL LAYER 5)和OCL3(OUTER CELL LAYER 3)基因為hub節點的共表達網絡，這一共表達網絡中還包含另外三種類型的基因，分别為3-酮酯酰-CoA合成酶基因(3-ketoacyl-CoA synthase)以及表皮蠟質合成基因(glossy genes)。OCL基因在形成籽粒表皮的角質層中發揮重要作用的結論已經在拟南芥以及玉米中被報道過，而在玉米雌穗的空間轉錄組圖譜中，OCL5基因明确表現出在雌穗分生組織的表皮細胞中特異表達的特征。是以，研究人員推測在該部位存在一個以OCL基因為核心的，與角質層合成相關的基因調控網絡，而這一結論與分生組織表皮細胞所行使的生物學功能高度吻合。此外，研究人員還鑒定到了一個在花序分生組織中特異性表達的共表達網絡，該網絡包含多個與海藻糖-6-磷酸合成相關的基因。而根據過去的研究，海藻糖-6-磷酸對于植物的生長發育非常重要。在該共表達網絡中，另一個NAC家族的轉錄因子NACTF25被鑒定為hub基因，并且在花序分生組織中特異性表達。是以，研究人員推測NACTF25可能通過調控與海藻糖-6-磷酸合成相關的基因表達來影響花序分生組織發育(圖3)。
圖3. 整合單細胞轉錄組與空間轉錄組資料建構細胞類型特異性共表達網絡
綜上所述，本研究通過結合關鍵發育時期下玉米雌穗的單細胞與空間轉錄組資料，建構了玉米雌穗的空間轉錄組圖譜。利用該圖譜能夠區分高度相似的分生組織類型，使我們能夠進一步研究分生組織在分化過程中産生的細微變化，并有助于鑒定關鍵的發育調控因子。圖譜中所有基因的表達模式(表達量與表達部位)以及在不同細胞類型中鑒定到的标記基因資訊均可以通過https://db.cngb.org/stomics/mdesta/通路查詢。
華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室和湖北洪山實驗室 楊甯 教授、劉磊 教授及深圳華大研究院 劉歡 研究員為該論文共同通訊作者。華中農業大學 王躍斌 博士、羅芸 博士、李雲富 博士、嚴佳麗 和深圳華大研究院 郭興 博士為該論文的共同第一作者。華中農業大學 嚴建兵 教授、張祖新 教授，美國冷泉港實驗室 David Jackson 教授，深圳華大研究院 徐訊 研究員參與指導了該項工作。華中農業大學 卓琳、魏文傑、丁倩、柏民基，以及深圳華大研究院 魏曉鋒、邵雯雯、陳麗華、黎麗、楊濤、陳靜 為研究提供了技術支援。該工作得到了農業生物育種重大項目、國家自然科學基金委優秀青年科學基金、國家重點研發計劃等項目的資助。
植物科學最前沿，專注于植物科學前沿進展、資訊、招聘資訊的釋出及方法軟體共享等。投稿及招聘請背景回複“投稿”，均為無償；商務合作請聯系微信ID：zwkxqy ；