本文作者：福建醫科大學 YANG
本文稽核專家：江蘇大學附屬醫院 李晶教授
引言
近年來，幹細胞成為細胞治療領域的熱門領域，涉及的疾病越來越多。冷凍儲存是最為常見的幹細胞儲存和運輸方式，成為目前的黃金标準。通過冷凍技術而長期存儲細胞，為後續的科學研究、疾病治療等提供資源。那麼，經過長期的冷凍後，幹細胞的活力和功能會改變嗎？根據發表的文獻，經過20年以上凍存，仍然可以獲得良好分化能力的間充質幹細胞。國内也有多個文獻證明，冷凍複蘇後臍帶/胎盤間充質幹細胞生物學特性仍保持穩定。這些科學文獻為冷凍存儲間充質幹細胞的未來應用提供了有力的證據。
近年來，深低溫存儲技術的發展，已經被廣泛應用至幹細胞儲存當中，推動了幹細胞存儲的發展，為幹細胞治療的臨床發展及應用奠定了基礎。越來越多的細胞治療在臨床開發過程中采用到了冷凍儲存工藝，基于冷凍儲存的細胞療法的新藥臨床試驗申請也相繼獲得準許。
随着冷凍儲存幹細胞的逐漸流行，人們對冷凍儲存後幹細胞的功能也有很多的興趣和好奇。比如，凍存20年或者30年後的幹細胞，它的活性和功能還保持得跟原來一樣嗎？今天我們通過最新的文獻來給大家回答。
文獻證明：
冷凍儲存20以上的間充質幹細胞仍具有強大的分化潛能
一項研究[1]将已經冷凍儲存23-25年的人細胞樣本解凍後擴增繁殖以獲得間充質幹細胞，并以新鮮采集的人細胞樣本作為對照，比較二者的恢複效率和生長特性以及分化潛能。
結果表明，二者間充質幹細胞在體外分化為成骨細胞、脂肪細胞和神經元細胞的能力相似。證明即便經過長期（23-25年）冷凍儲存，仍可以獲得具有良好分化能力的間充質幹細胞。
在這項研究中，研究人員評估長期冷凍儲存的間充質幹細胞（MSCs）的活力及分化潛能。結果發現：
（1）盡管長期冷凍儲存和解凍後部分細胞被損壞，但經過培養仍然可以獲得适量的貼壁健康細胞。
（2） 可以從長期冷凍儲存的原代培養物中擷取到間充質幹細胞。
比如，在研究中，3天後凍存組和對照組均可見小棱柱貼壁細胞，培養10天後數量增多。第 14 天時，兩組貼壁細胞均呈現螺旋狀生長。14天後，冷凍組和對照組中成纖維細胞樣細胞的百分比分别為88.2±4.3%和89.1±3.8%（p>0.05）。當根據存活細胞數量計算時，兩組都具有相似的增殖能力。通過測定了MSCs常見分子标記的表達，表明上述成纖維細胞樣細胞确實是MSCs。
圖檔來自文獻[1]
（3）長期冷凍儲存間充質幹細胞仍具有強大分化潛能：結果表明，凍存組和對照組獲得的P3培養物分化成成骨細胞、脂肪細胞和神經元細胞的能力沒有顯着差異，表明長期凍存和解凍并未損害間充質幹細胞的分化潛力。
系統綜述提供進階别證據：
冷凍儲存不會影響幹細胞活性及功能
為了進一步驗證上述實驗得出的冷凍儲存不會影響幹細胞活性及功能的結果。另一研究團隊進行了一項系統綜述評價[2]，該研究發表于國際期刊《Journal of Translational Medicine》,通過納入41 項體外研究進行綜合分析，得出和上述實驗一樣的結論：冷凍儲存不會影響間充質幹細胞的形态、表面标志物表達、分化或增殖潛力。為上述結果提供了更進階别的證據。
該研究使用 PubMed、Science direct 和 Google Scholar 進行系統文獻檢索，最終納入41項研究，詳細了解每篇文章的冷凍溶液成分、冷凍方案、儲存時間、冷凍細胞濃度、冷凍傳代數以及解凍方法等資訊。并提取有關細胞表面标志物表達、分化潛力、增殖和生長、附着和遷移潛力、基因組穩定性和旁分泌功能。此外，還對解凍後的活力和形态資訊進行了整理。（下圖為流程圖）
圖檔來自文獻[2]
最終分析結果表明[2]：冷凍儲存不影響間充質幹細胞的形态、表面标志物表達、分化或增殖潛力。然而，關于對集落形成能力的影響存在不同的結果，對活力、附着和遷移、基因組穩定性和旁分泌功能的影響尚未确定，這主要是由于不同研究的冷凍儲存過程的巨大差異以及缺乏标準化的檢測方法。是以，未來需要進行進一步的評估以及建立統一的冷凍儲存體系。
小結
毫無疑問，幹細胞已經成為目前疾病治療的研究熱點，其中冷凍存儲技術在其中起到了重要的作用。利用冷凍存儲的間充質幹細胞來開發細胞療法已經被越來越多的國内外研究團隊采用。是以有關冷凍儲存後幹細胞的活力和功能也一直是衆多學者的關注焦點。以往的研究已經表明冷凍儲存的安全性及有效性，不會影響幹細胞解凍後的活力和功能。
目前國内比較流行的臍帶和胎盤組織間充質幹細胞的冷凍存儲，這類間充質幹細胞長期冷凍儲存以後其生物學功能仍然保持穩定，這已經被文獻證明[3]。間充質幹細胞的冷凍存儲技術對細胞治療發展具有重要意義，可以提高幹細胞治療的可行性和有效性，為更多患者提供創新的治療選擇。然而，幹細胞冷凍儲存需要全流程的高品質标準和技術保障體系，方能為臨床應用提供安全保障！
參考文獻：
[1] Shen JL, Huang YZ, Xu SX, Zheng PH, Yin WJ, Cen J, Gong LZ. Effectiveness of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow cryopreserved for 23-25 years. Cryobiology. 2012 Jun;64(3):167-75. doi: 10.1016/j.cryobiol.2012.01.004. Epub 2012 Jan 18. PMID: 22280954.
[2] Bahsoun S, Coopman K, Akam EC. The impact of cryopreservation on bone marrow-derived mesenchymal stem cells: a systematic review. J Transl Med. 2019 Nov 29;17(1):397. doi: 10.1186/s12967-019-02136-7. PMID: 31783866; PMCID: PMC6883667.
[3] 王友臣,柴亮,史恩祥,等.人臍帶間充質幹細胞凍存複蘇後生物學性狀研究[J].解放軍醫藥雜志, 2011(A04):4.DOI:10.3969/j.issn.2095-140X.2011.04.001.