白木香結香技術大揭秘，了解一下！
張立寶等
國家自然科學基金（32060357）。
白木香（Aquilaria sinensis）屬瑞香科沉香屬，因其所結香脂豐富，入水即沉而得名 ，又名土沉香、牙香樹、女兒香、崖香、青桂香、莞香、芸香 ，當植物的樹幹受外界不良因素影響後留存的病理組織即為沉香，若所結香脂較少，不可于沉水，則稱為黃熟香、棧香 ；一般為褐色至深黑色，且随顔色加深其品質也随之提高 。分布于大陸廣東、海南、廣西、福建、雲南、台灣等低海拔山地和丘陵的常綠闊葉混交林中，被《中華人民共和國藥典:2020 年版·一部》規定為國産沉香唯一的植物來源 ，是大陸特有的名貴藥源植物。白木香所結沉香具有調節中樞神經系統、抗炎、抗菌、抗惡性良性腫瘤、抗抑郁、抗氧化、降血糖、調血脂、解熱鎮痛等活性，可用于治療胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、咳嗽、風濕、高燒、腎虛氣逆喘急等症狀，還對糖尿病、阿爾茨海默病等疾病有潛在的治療作用 ，是以被曆代名醫追捧為上品藥材。除此之外沉香又多被用于制成香或進階化妝品或具有收藏價值的工藝品等，葉片可制成茶葉沖泡飲用 。
自然條件下，白木香結香率極低，人們對沉香的需求不斷增長，随着野生沉香資源的掠奪式砍伐，加之生境的破壞，野生沉香樹種瀕危滅絕，急需通過人工結香技術提高結香效率與品質。現有研究成果表明：人工結香技術主要分為實體創傷法（鑿洞法 、砍傷法 、火烙釘釘法 、火燒樹幹法 、斷幹或斷枝法）、化學誘導（乙烯利、茉莉酸甲酯、水楊酸、氯化鈉、甲酸、氯化亞鐵、三氯化鐵和亞硫酸鈉 ）、人工接菌誘導（黃綠墨耳菌 Melanotus flavolives、鐮刀菌Fusarium laseritum、可可毛色二孢菌 Lasiodiplodia theobromae、斑點青黴 Penicilluma meleagrinum、黑綠木黴 Trichoderma atroviride、拟康氏木黴 Trichoderma koningiopsis、青黴病病原菌 Penicilliumitalicum、腐皮鐮孢 Fusarium solani、柑橘葡萄座腔菌 Botryosphaeria rhodina、拟層孔菌 Fomitopsissp.、葡萄座腔菌 Botryos rhodina ）等方法誘導結香。但是現有結香方法都有不足之處，實體創傷法主要是通過不同方式對白木香樹體進行人工實體傷害迫使白木香樹體産生植物防禦反應，在次生代謝的作用下産生的褐色至深黑色病理組織—沉香。不同的實體處理方式各有千秋，優點在于操作簡單、成本低；缺點在于實體法結香結香速度慢，取香時間長，結香隻聚集在傷口附近且産量有限，甚至會造成樹體死亡。而化學法誘導結香極大提高了結香速度且操作簡單，其主要利用化學試劑或其組合形式，誘導或迫使白木香産生脅迫反應進而産生沉香物質。不足之處在于所産沉香味道刺激性較強，價格低，目前還不被市場認可，而且使用的化學藥劑是否會對環境造成污染、所産沉香能否達到國家藥典要求、使用後對人體有無毒害等因素目前還尚不明确。人工接菌誘導結香是使用經過篩選的可誘導白木香産生沉香物質的内生真菌或外源真菌，此方法相較于二者進一步提高了結香效率，保障了結香品質，同時無任何化學添加劑不會對樹體以及環境造成污染，是目前應用較為廣泛的人工結香方式。
通體結香技術是魏建和研究員首先提出的白木香防禦誘導反應結香假說 的基礎上研發的世界領先的結香技術，為白木香結香機理提供了重大理論與現實價值，對白木香人工結香技術提供了強大的核心技術支撐，對解決沉香人工結香技術瓶頸，邁出了重要一步。本文根據白木香防禦誘導結香機理，借鑒通體結香打點滴法原理自主研發了結香液，将結香液提前灌裝至尖嘴瓶中，插入提前打好的孔洞中利用植物自身代謝作用使結香液通過木質部運送到樹體各個部位，進而整樹内部可誘導結香。同時還可利用蛀蟲駐食作用攜帶結香液，以蟲帶菌形式進行侵染并與蟲蛀和機械打孔兩種結香方式形成對比來驗證侵染效果。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 白木香基地概況 白木香基地位于雲南省西雙版納傣族自治州納闆河自然保護區内，選取平均幹徑 20 cm以上，樹齡 15 年，樹況良好的白木香樹。
1.1.2 文獻可視化分析資料 文獻資料來源于 CNKI（http://www.cnki.net）資料庫，截至 2023 年 2月 16 日共檢索到文獻 49 篇以“通體結香”為主題進行檢索，所有檢索結果導出為 Refworks 格式備用。
1.1.3 白木香結香誘導真菌及蛀幹昆蟲 本試驗所用菌株均來自雲南省林業和草原科學院森林保護研究所，内部編号為 YB-1、YB3-1、HLH、YML,現由雲南省林業和草原科學院森林保護研究所儲存；蛀幹昆蟲為天牛幼蟲。
1.1.4 白木香結香液制備 白木香結香液是本課題組根據打點滴法結香原理，自主研發的利用可明顯誘導白木香結香真菌接種于培養液的發酵液。利用剪切機對結香液中菌絲進行剪切，轉速 15 000r/min，持續 2 min，以 15 mL/瓶的容量分裝至特制尖口瓶中備用。
1.2 試驗方法
1.2.1 文獻可視化分析 利用 CiteSpace 6.1R6 [34] 将檢索文獻結果轉換後，根據文獻檢索結果，設定分析時間為 2010 年 12 月至 2023 年 1 月，以關鍵詞為分析目标，使用網絡圖裁剪（Pathfinder)與裁剪合并網絡（pruning slice d networks）算法，其餘預設。
1.2.2 白木香人工結香處理 機械打孔處理作為本試驗 CK 對照，同時又是其他 3 個處理的前提，主要利用手持锂電鑽距地面 50 cm，自下而上，間距 10～15 cm、行距 20 cm、鑽徑 10 mm、傾角45°打孔，孔深為幹徑的 1/3；結香液處理是直接将灌裝好結香液的尖口瓶插入電鑽打好的孔洞中即可；蟲蛀處理是利用鑷子将天牛幼蟲直接放入孔中，并用保鮮膜圍樹幹孔洞自下而上包裹防止其逃逸造成生物災害，同時使用昆蟲針在洞口紮眼保證通風通氣，避免其窒息死亡；蟲帶菌處理不同與蟲蛀處理的地方在于此處理需要使用鑷子将桔褐天牛幼蟲夾起在裝有結香液燒杯中均勻蘸取 1～2 s，而後迅速放入孔中，其餘均與蟲蛀處理相同。每樹為 1個處理、且 3 個重複，統一編号并且樹上挂牌标記（表 1）。
1.2.3 樣品采樣 人工結香處理 2 個月後，利用打孔器對樹體結香部位取樣，晾幹後備用。
1.2.4 醇提物提取 每份樣品稱取 2 g 加入錐形瓶内，加入無水乙醇 50 mL靜置 1 h，随後置于水浴鍋中以 80 ℃水溫水浴萃取 1 h，将蒸發皿提前 3 h烘幹并稱量空皿品質，立即加入濾後的萃取液 25mL，水浴鍋蒸 1 h後，測蒸發皿品質，随後計算醇提物含量。
1.2.5 資料分析與制圖 試驗結束 2 個月後對所有處理的侵染效果利用直尺進行測量并測算侵染面積（表 2）。根據試驗資料利用 Graphpad prism 8.3.0繪制白木香不同處理侵染面積圖（圖 2）。
表 1 白木香不同處理方式編号
表 2 白木香不同處理侵染面積
2 結果與分析
2.1 通體結香文獻分析
根據 CiteSpace 分析結果顯示（圖 1），含有沉香、白木香、通體結香等關鍵詞的文獻數量較多，分别有 32、21、7 篇。表明通體結香技術主要應用于白木香，而結香方法、抗炎活性、化學成分、品質、藥理作用、急性毒性、差異成分、品質評價、半倍萜等關鍵詞占比較大，表明現有通體結香技術效率較低，所結沉香參品質差不齊，差異較大等問題依然突出，近年來分子組學等技術手段加速了結香機理的研究，但現有人工結香效率仍需改善，結香品質仍需提高，所結沉香醇提物含量是否滿足國家《藥典》要求以及明确結香機制尤為重要。
圖 1 通體結香關鍵詞聚類分析圖
2.2 侵染效果分析
根據 Graphpad prism 8.3.0對試驗資料進行統計，根據試驗結果可知，侵染面積由大到小依次為：蟲帶菌、蟲、結香液、CK 對照。表明 CK 對照侵染面積最小且所有處理侵染效果都高于 CK 對照，具有加速結香效果；蟲帶菌處理整體侵染面積最大，說明蟲帶菌是本試驗所有進行中最佳組合；蟲蛀處理高于結香液處理表明加速樹體結香的關鍵因素在于蟲（圖 2）。
圖 2 白木香不同處理侵染面積圖
2.3 醇提物含量分析
根據各人工結香技術所結沉香測得含量可知：所有處理沉香四醇含量均高于機械對照方式，說明 3 種人工結香方式可以促使白木香樹體結香，并且相較于傳統結香方式可加速結香，YB-1 以蟲帶菌結香方式所得醇提物含量要明顯強于其他所有結香方式，表明 YB-1 是誘導白木香結香的優勢菌株，同時與蟲結合的蟲帶菌方式是最佳組合，而其餘菌株與不同處理之間無明顯差異。
圖 3 沉香四醇含量
3 讨論
年度發文量是衡量某一學術領域研究進展的重要名額 [35] ，縱觀通體結香最新研究成果發現，關鍵詞“沉香”“白木香”“通體結香”頻率最高；結香品質、藥效作用以及結香技術與機理相關文獻占比較大是時下熱點研究内容。
通體結香技術所結沉香所含醇提物含量是影響結香品質的關鍵因素之一，而沉香四醇是醇提物主要成分之一，是鑒定真僞沉香的關鍵名額；沉香品質評價的研究主要集中在性狀描述、顯微鑒别、薄層鑒别、理化鑒别、浸出物含量、揮發油等方面 [36-39] ，是以提高通體香醇提物含量是目前點研究重内容之一；
通體香的藥效研究主要集中于調節腸胃動力，保護肝髒、心髒，鎮靜、抗炎等研究。然而現階段結香機理尚未明确，目前主要傾向于白木香防禦反應誘導結香假說，認為傷害或真菌侵染均是作為激發子誘導白木香産生防禦反應的動因，進而迫使樹體産生具有抑菌活性的防禦物質，即藥材沉香的主要化學成分，這些防禦物質與細胞其他組分複合形成的侵填體堵塞了次生木質部的導管和維管束，以抵禦外界實體、化學傷害或真菌侵染對白木香的進一步損傷 [40] 。但本研究具有一定局限性：CNKI 資料庫與其他資料庫相比，以“通體結香”為主題的文獻較少，其次由于時間較短，所結沉香醇提物含量較少還未能達到《藥典》要求。
通過本文研究發現結香液、蟲帶菌、蟲 3 個處理方式相對于一般實體結香技術具都有促進作用，且蟲帶菌組合形式侵染效果最好，要強于結香液與蟲蛀處理，表明蟲帶菌是最佳的誘導結香方法，真菌誘導結香本身具有結香速度快，結香品質高，所産沉香結香天然沉香的優點，加之鑽蛀昆蟲具有較強自主擴散能力，友善管養（人工飼養或助遷繁育），便于林間釋放和人為管控，所裡利用鑽蛀昆蟲協同真菌侵染的結香技術，效率會更加高效和快捷，侵染效果更加優越，誘導獲得的沉香會更加天然優質，最終達到通體結香效果。如果能夠探明昆蟲蛀蝕協同真菌侵染誘導白木香結香的過程與機理，進而提出相應的“蟲菌”結香技術或方法，這将是一項重大的結香技術革新。
現有結香方式雖然在一定程度上加快了結香效率與品質，但是整體依然存在産量低、周期長、品質參差不齊等現象，白木香結香的最佳效果為通體結香效果，業界普遍認為蟲漏沉香是最優質的天然沉香，也是達到通體結香的最佳方式。目前關于蟲漏沉香的報道中天牛、木蠹蛾、白蟻等昆蟲可誘導白木香結香 ，是以本課題組為了知曉導緻“蟲漏”的主要昆蟲及其伴生真菌的種類，利用昆蟲、真菌或其伴生菌以及利用鑽蛀昆蟲攜帶結香高關聯性真菌（比如：鐮刀菌屬 Fusarium sp.、青黴屬 Penicillium sp.、木黴屬 Trichoderma sp.、黃綠墨耳菌、可球二孢菌 Botryodiplodia sp.等）協同侵染誘導白木香結香，即通過人為幹預，借助“昆蟲+真菌”聯合侵染誘導白木香結香。本文主要對通體結香技術研究現狀進行分析，并以蟲帶菌誘導結香試驗驗證結香效果，以期最終達到通體結香的效果。