寫在前邊：
IDT 成立于 1989年，是基因組學領域開發的領先者，也是公認的定制核酸生産行業的上司者。IDT 憑借在 DNA 合成領域的上司能力，為基因組學應用開發了專有技術，例如下一代測序、CRISPR 基因組編輯、合成生物學、數字 PCR 和 RNA 幹擾。通過 GMP 服務，IDT的産品被科學家用于研究多種癌症以及大多數遺傳性和傳染性疾病。IDT 在亞洲、歐洲和北美洲設有工廠，為一百多個國家及地區的超過十二萬名生命科學界研究人員提供服務，每天生産的寡核苷酸數量 超過七萬份。
北京澤平科技有限責任公司成立于2003年3月，一直緻力為中國使用者提供全球最先進的生物試劑、科學儀器、實驗室消耗品、化工原料及醫藥中間體等技術服務。品牌成立至今，已與近百家國際一線技術供應商品牌建立了長效穩定合作機制，産品技術服務囊括近20w多個品類。立足北京，放眼全球，澤平科技“以最先進技術服務使用者”為己任，國内服務使用者已超過20000家。澤平科技和IDT公司達成合作，将進一步為使用者開放CRISPR基因組編輯等的産品服務。歡迎廣大使用者咨詢。
在qPCR實驗過程中，合理的實驗設計，探針及引物的高品質合成是其成功的關鍵。qPCR目前依然是核酸熒光定量檢測的正常實驗，然而獲得信号特異、低背景的qPCR結果也非易事。從qPCR小白到大神，學習和摸索是少不了的。但是，君子生非異也，善假于物也，IDT PrimeTime®️系列産品，便是助您qPCR快速進階的可“假”之“物”。
熒光 / 淬滅基團怎麼選？
熒光探針是qPCR實驗的核心，确定實驗目的後，首當其沖的是确定探針的類型，尤其是熒光基團和淬滅基團。
圖1則是來源于IDT并在科研界廣為流傳的熒光基團選擇表：根據qPCR儀支援的熒光通道選擇合适熒光基團。
圖1. 常見qPCR儀适配的熒光基團。
此處友情提醒，請盡量選擇無需校正（Calibration）的熒光基團，以減少多餘的“工作量”。圖1所列熒光基團發射波長由短至長（520 nm ~ 668 nm）依次排列，當選擇多個熒光基團時，盡量選擇間隔遠的可減弱熒光串色現象，提高檢測靈敏度。
PrimeTime®️ qPCR系列探針涵蓋了常見熒光-淬滅組合，可根據圖2直接進行選擇。請注意圖2中對熒光、淬滅基團專利方面的相關備注，除了特殊備注外，大部分從IDT訂購熒光-淬滅組合均免專利許可費。
圖2. IDT常見熒光淬滅基團組
讀到這裡，有些qPCR中級選手有了疑問：為什麼沒有我經常使用的淬滅基團BHQ1（Black Hole Quencher®️-1）和BHQ2（Black Hole Quencher®️-2）？
主要原因在于上述兩種淬滅基團屬于某公司專利，其他公司若要進行商用，需支付相應的專利費用（IDT也可提供BHQ系列淬滅基團探針）。而與之相比，IDT自行開發的IBFQ（Iowa Black®️FQ）和IBRQ（Iowa Black®️ RQ）淬滅基團，其表現與BHQ系列類似，且無需任何專利費用。
圖3. 不同熒光基團的發射波長及淬滅基團的選擇
各級qPCR選手又有了疑問：圖2中的ZENTM和TAOTM又是“何方神聖”？
ZENTM和TAOTM 指在探針第9、10堿基之間添加的第二淬滅基團。熒光基團ZENTM-IBFQ / TAOTM-IBRQ組合而成雙淬滅探針，可實作優于BHQ的淬滅效果，而價格上比BHQ單淬滅基團更低[1]。
當使用FAM熒光基團與不同淬滅基團：ZENTM-IBFQ、BHQ1、Eclipse®️、IBFQ和TAMRA組合的5’核酸酶探針進行qPCR實驗，背景和信号的熒光強度對比見圖4。雙淬滅探針以更低的背景和更高的熒光信号脫穎而出。
圖4. FAM搭配不同淬滅基團背景與信号對比圖。在ABI 7900HT Real-Time PCR儀器上，對0.5 ng cDNA利用5種qPCR探針對ACTB基因進行檢測。
IDT提供的雙淬滅探針作為5’核酸酶探針中的佼佼者，已成為越來越多高靈敏度檢測中的不二選擇。2017年9月Chao Shan等人發表在Nature Communication雜志的《針對3’UTR區域缺失的寨卡病毒基因組的單劑量減毒活疫苗可防止寨卡病毒的妊娠傳播和引起的睾丸損傷》研究中，在小鼠模型上使用IDT雙淬滅探針（ZENTM -IBFQ）進行病毒載量的檢測，檢測下限可低至100拷貝/mL（圖5）[2]。
圖5. 利用qRT-PCR 在不同免疫後時間點對病毒基因組的定量檢測。虛線代表檢測下限。（IDT雙淬滅探針FAM-/ZEN/-IBFQ）
IDT雙淬滅探針“加強不加價”，是以無論從功能還是成本上，我們都推薦大家使用雙淬滅探針。
關于雙淬滅探針更多的資訊及應用執行個體，可參考《兩道“消防線”，守住你的qPCR”》。
想要檢測更靈敏，如何用好LNA？
PrimeTime®️ 探針中還可以通過增加鎖核苷酸（LNA, Locked nucleic acid）來增加探針的Tm值，得到“短小精悍”的PrimeTime®️ LNA探針。
LNA相對結合親和力較強，一般來講LNA:LNA > LNA:DNA > DNA:DNA。LNA堿基的位置與序列有關，match和mismatch的∆Tm一般＞15℃。是以，較短的PrimeTime®️ LNA探針擁有更好的淬滅效果，信噪比較低，提高了識别SNP的能力，常被應用于一些難檢測的SNP和AT-rich區域的探針設計。
在設計方面我們建議如下：
- 避免二級結構：LNA:LNA易形成二聚體和發夾結構[3]。設計時，可利用IDT線上oligo分析工具Oligo Analyzer®️ Tool預測二級結構。
- LNA位置很重要：LNA應放置在SNP位點及其相鄰的堿基上，避免放置在第一個和最後一個堿基。PrimeTime®️ LNA探針中，最多包含6個LNA，且不要同時連續放置4個以上LNA。
- 控制擴增子長度：标準qPCR建議擴增子長度可達150 bp。用數字PCR或短片段樣本（如cfDNA，FFPE等樣本）時，擴增子的長度建議控制在80-100 bp。
2017年劄幌東京醫院生物醫學研究所的Yusuke Ono等人在研究中，為了克服癌症早期因cfDNA含量有限且KRAS突變頻率較低造成的早診瓶頸，在ddPCR平台引入預擴增步驟，并利用PrimeTime®️ LNA探針，在減少背景噪音的同時大幅度提高檢測KRAS突變的靈敏度（圖6）[4]，使得cfDNA KRAS突變的檢測下限低至0.01%。
圖6. 使用ddPCR檢測突變KRAS探針的靈敏度和特異性。模闆為攜帶已知KRAS突變的cfDNA，使用含有PrimeTime LNA探針，将突變和野生比例分别以10%，1%，0.1%，0.01%混合，證明該方法的檢測下限為0.01%。
如何省時省力做設計？
最簡單的當然是“拿來主義”，使用IDT的預設計！
IDT提供的PrimeTime®️ qPCR 預設計檢測包（Predesigned assay）包含一對引物和qPCR探針。這些預設計涵蓋了人、小鼠、大鼠的大部分基因，既從堿基組成、長度等方面優化探針，還利用生信方法評估涉及的SNP位點（基于NCBI RefSeq資料庫），可有效避免非靶區域擴增、剪切變異體和探針内部二級結構。
值得一提的是，IDT對于常見信号通路的基因位點均提供預設計（圖7）。IDT承諾所有預設計擴增效率達到90-110%，R2>0.99，若無法達到，則不收費。
圖7. 常見信号通路基因位點表
若預設計庫中沒有您想挑選的“對象”，還可利用IDT線上工具PrimerQuest®️ tool，針對任意種屬的任意序列進行線上設計。關于設計的諸多Assay如何進行選擇，IDT在Tm、GC含量，檢測目标位置和擴增子長度等IDT已有詳細的經驗總結供大家參考。
表1. qPCR設計要點
好馬還要配好鞍，Master Mix 哪家強？
有了引物和探針，最後不能忘了反應環境！
PrimeTime®️ Gene Expression Master Mix 是IDT專利設計的2×預混型高效qPCR試劑，搭配Assay即可進行qPCR實驗，可保證擴增效率高于90%。該混合液也适用于多重反應，在标準和快速循環條件下均表現良好。另外，Master Mix不僅可以搭配PrimeTime®️系列探針，也完全相容市面其他品牌的Probe-based qPCR實驗。同樣，在應用于商業或診斷時無需任何專利費用。
圖8. PrimeTime Gene Expression Master Mix 在标準和快速PCR循環條件下Cq值一緻性較高。該反應配套使用PrimeTime qPCR Assays, PrimeTime Gene Expression Master Mix, reference dye，和cDNA梯度稀釋模闆（0.016–50 ng）, 每個濃度的cDNA在不同反應條件下Cq值差異＜1。
Master Mix除包含有Hot-start Taq DNA 聚合酶、dNTP、MgCl2外（附送單獨包裝的參考染料），還含有特殊的增強劑和穩定劑。因而其穩定性堪稱Mix中的“Master Shifu”，即使經曆長達7天50℃放置，仍具有高擴增效率且Cq值穩定（圖9）。
即使周五實驗完成後忘記放回冰箱，下周照樣使用。
圖9. PrimeTime Gene Expression Master Mix 在50°C 長達7天獲得的一緻性結果。該反應配套使用 PrimeTime qPCR Predesigned Assay (ID: Hs.PT.58v.45621572)，50℃條件下分别選擇1，3，5和7天時間點進行檢測。
以上就是PrimeTime®️ 裝備一覽，IDT官網提供的OligoAnalyzer Tool，PrimerQuestTool等線上工具更将使您qPCR進階之路如虎添翼。