賈甯，目前在南方科技大學擔任副教授，主要研究微生物與宿主免疫系統。2022 年，她曾入選《麻省理工科技評論》“35 歲以下科技創新 35 人”亞太區榜單。
圖 | 賈甯（來源：南科大官網）
不到一年時間，好消息再次傳來。前不久，她和合作者成功揭開 IV-A 型 CRISPR-Csf 系統的“神秘面紗”，讓學界對于 CRISPR-Cas 系統的了解得以加深，為開發相關基因編輯工具并将其用于臨床研究奠定了基礎。
研究中，借助生物化學、微生物學、結構生物學等手段，她和團隊揭示了如下分子機制：細菌可以利用 IV-A 型 CRISPR-Csf 系統的免疫防禦能力，抵禦外源質粒的入侵。
這一成果為了解 IV-A 型複合物的結構和功能做出重大貢獻，也為進一步确定 IV-A 型 CRISPR-Csf 系統的體内功能鋪平了道路。
日前，相關論文以《IV-A 型 CRISPR-Csf 複合物：組裝、dsDNA 靶向和 CasDinG 募集》（Type IV-A CRISPR-Csf complex: Assembly, dsDNA targeting, and CasDinG recruitment）為題發在 Molecular Cell（IF 16），CuiNing 是第一作者，賈甯和南科大副教授黃鴻達擔任共同通訊作者。
圖 | 相關論文（來源：Molecular Cell）
盡管投稿過程耗時一年多。但是賈甯表示：“最終，評審專家評價稱我們‘用冷凍電鏡解析了所有重要的功能狀态，特别是首次捕捉到了 IV 型 Csf 系統與效應蛋白 CasDinG 複合物的結構，代表着 IV 型研究的一個重大飛躍’。看到這樣的評價我真的很高興，這是對我們工作的極大肯定。”
（來源：Molecular Cell）
“神秘”的 IV 型 CRISPR-Csf 系統
作為細菌的獲得性免疫機制，CRISPR-Cas 系統能夠“記住”曾入侵過的噬菌體或外源質粒，當後者再次入侵時，CRISPR-Cas 系統可以切斷它們的基因組，讓其無法複制和表達，進而抵禦噬菌體或質粒等外源核酸的入侵。
由于能夠特異性地識别 DNA/RNA，CRISPR-Cas 系統已被開發成為一種高效的基因編輯工具，并被廣泛用于生物技術、臨床應用、基礎研究等方面。
研究 CRISPR-Cas 技術的兩位科學家也是以獲得 2020 年諾貝爾化學獎。同時，該技術曾經三次被 Science 評為年度十大科學進展，可見其在科學領域的重要意義。
根據效應蛋白的組成，CRISPR-Cas 系統可被分為兩大類：第一類（Class1）效應蛋白，是由多個 Cas 蛋白組成的複合物；第二類（Class2）效應蛋白，由單個 Cas 蛋白組成。
目前，已經得到鑒定的 CRISPR-Cas 系統累計包含六種（I-VI）。除了 IV 型 CRISPR-Csf 系統外，其他類型的功能和作用機制，均已得到詳細報道。
其中，IV 型 CRISPR-Csf 系統是最為神秘的一類。該系統又可進一步分為從 IV-A 到 IV-E 等五種亞型。
IV 型 CRISPR-Csf 系統的特殊之處在于，它更多存在于質粒上而非存在于染色體上。并且，IV 型 CRISPR-Csf 系統對于同一宿主的其他質粒具有極強的靶向性，是以有可能會介導宿主中不同質粒之間的競争。
耐藥菌感染，是當下臨床治療中的棘手問題。更嚴重的是，通過質粒水準的轉移，耐藥基因會在細菌中傳播擴散，進而加劇微生物耐藥所帶來的公共衛生安全問題。
近期，在臨床分離的多種耐藥肺炎克雷伯菌的質粒上，學界也發現了 IV 型 CRISPR-Csf 系統的存在。另外，有研究表明該系統可以靶向其他質粒中的轉移基因，這暗示着 IV 型 CRISPR-Csf 系統可能具備對抗攜帶耐藥基因質粒的能力。假如這一能力确實存在，将有希望用于耐藥菌感染的治療。
而在目前已經得到鑒定的 6 類 CRISPR-Cas 系統中，IV 型 CRISPR-Csf 系統是唯一一種結構與功能均處于未知狀态的系統。
正是 IV 型 CRISPR-Csf 系統的神秘作用機制以及巨大的臨床應用潛力，引起了賈甯等人的極大興趣。
識别 IV 型 CRISPR-Csf 系統的“廬山真面目”
為了揭開該系統的“真面目”，該團隊使用銅綠假單胞菌的 IV-A 型系統，來對效應蛋白進行共同表達。
這時，效應蛋白會和 crRNA 形成效應複合物 CsfcrRNA。但是，課題組發現該系統的特征蛋白 Csf4（CasDinG）并不存在其中。
接着，通過生化實驗課題組證明 CsfcrRNA 可以特異性地識别靶 dsDNA，後又利用冷凍電鏡單顆粒方法解析了 CsfcrRNA 與靶 dsDNA 結合複合物的冷凍電鏡結構，借此揭示了 IV-A 型 CRISPR-Csf 系統的組裝、crRNA 成熟以及靶 dsDNA 識别的分子機制。
結構分析和生化實驗的結果顯示，相比 I、II、V 型 CRISPR-Cas 系統，IV-A 型 CRISPR-Cas 系統能夠識别的 PAM 序列範圍更廣，這說明其具備廣泛的 DNA 識别特性，暗示着其具有更大的應用價值。
而在最初的複合物結構中，他們并沒有發現 CasDinG 這一複合物。但是，在 IV-A 型 CRISPR-Csf 系統抵禦外源質粒入侵時，CasDinG 發揮着必不可少的作用。
為了探究 CasDinG 的具體功能，該團隊又把 CasDinG 單獨地純化出來，通過 X- 射線晶體學技術解析了 CasDinG 的結構。
後來，他們發現 CasDinG 是一種 5′-3′DNA 解旋酶，依賴于腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）而存在。
盡管 CasDinG 不能直接與 CsfcrRNA 形成複合物，但是 CasDinG 具有結合 DNA 的能力。
于是課題組猜測：是不是 CasDinG 能被 CsfcrRNA-dsDNA 三元複合物所招募？
為驗證這一猜想，他們設計了不同版本的 dsDNA，最終證明上述猜測完全正确。
更有意思的是，進一步的生化實驗結果顯示，在 ATP 的存在之下，CasDinG 能将靶 dsDNA 從 CsfcrRNA-dsDNA 複合物中解旋下來。
為進一步探明上述現象，他們利用冷凍電鏡解析了 3Å CasDinG-CsfcrRNA-dsDNA 的結構，發現 CasDinG 能夠和不同的 Csf2 亞基互相作用，這說明 CasDinG 可能會沿着 Csf2 亞基進行滑動進而解開靶 dsDNA。
而被解旋的單鍊 DNA，很有可能被細胞中的 DNA 酶所降解，進而導緻目标質粒的降解。
綜合以上發現，該團隊提出了一款模型，涵蓋了 IV-A 型 CRISPR-Csf 複合物組裝、靶向 dsDNA、招募 CasDinG 蛋白、以及 dsDNA 解離等過程。
目前，應用最為廣泛的基因編輯工具是 DNA 靶向的 CRISPR-Cas9 系統和 CRISPR-Cas12 系統，兩者都屬于第二類（Class2）效應蛋白，即隻由一個效應蛋白組成，組成上相對簡單是以更容易進行操作。
但是，在識别 DNA 的時候，它們都得依賴靶向基因位點上特定的短 DNA 序列，這種序列的名字叫做 PAM 序列。并且，CRISPR-Cas9 系統和 CRISPR-Cas12 系統可以識别的 PAM 序列比較少，導緻其适用範圍較為局限。
是以，開發新型基因編輯系統、拓寬 DNA 序列的編輯範圍，是領域内的重要研究方向。
雖然 IV 型 CRISPR-Csf 系統，是由多個蛋白組成的複合物。但是，用于編碼這一系統的基因僅為 3159bp，比目前廣泛應用的 spCas9（4104 bp）還要小。
這意味着，IV 型 CRISPR-Csf 系統更容易被遞送到細胞之内，臨床應用潛力十分可觀。而且，它能識别更加寬泛 PAM 位點，可編輯範圍相對較大，适用範圍也更廣闊。
此外，IV 型 CRISPR-Csf 系統也能存在于耐藥菌株之中，故能和耐藥基因互相關聯。這樣一來就能形成一個内源系統，進而有潛力用于對抗日益嚴重的耐藥菌傳播。
同時，作為一種多亞基的複合物，IV 型 CRISPR-Csf 系統可以在多個位置耦聯其他效應蛋白比如表觀修飾酶、熒光蛋白等，進而能夠帶來更大的應用範圍。
如前所述，在所有 6 大類 CRISPR-Cas 系統中，針對 IV 型 CRISPR-Cas 系統的研究最為“模糊”。
盡管此次研究揭示了該系統靶向目标 DNA 以及招募特征蛋白的機制。不過，目前依舊不清楚為何這一系統主要存在于質粒中，以及它和多重耐藥菌的抗生素基因到底有何關系，也不清楚為何該系統的靶标更加偏好質粒而不是染色體 DNA。
是以，課題組将圍繞該系統與質粒 DNA 間的互相作用展開，進一步确定它的功能和作用機制。同時，也會嘗試進行應用層面的改造，希望将來可以真正用于生物醫藥領域。
（來源：Molecular Cell）
博後期間曾獲一項美國化學獎
另據悉，在加入南科大之前，賈甯曾在美國紀念斯隆凱特琳癌症中心做了三年多的博後研究。
博後期間，她和當時所在團隊闡述了古細菌的分子機制：即利用 RNA 靶向的 III 型 CRISPR-Cas 系統效應複合物，可以系統性地介導靶 RNA 降解、DNA 酶活調節、以及自身免疫調節來抵禦噬菌體[2]。
CRISPR-Cas 系統可以通過識别、并降解入侵噬菌體的 DNA 或 RNA，來讓外源基因的表達歸為“沉默”。與此同時，噬菌體同樣進化出了相應的防禦工具 anti-CRISPR 蛋白，進而能以特異性的方式讓 CRISPR-Cas 系統失去活力。
基于上述工作，賈甯還和合作者揭示了 anti-CRISPR 蛋白 AcrVIA1 幫助噬菌體逃逸的分子機制。
對于細菌來說，它能利用傳統 CRISPR-Cas 系統所具有的核酸酶活性，降解外源入侵的核酸，進而抵禦噬菌體的入侵。
同時，核酸酶缺陷的的 I-F Cascade 系統，會被細菌用于 RNA 介導的 DNA 轉座。
而在博後期間的另一項工作中，賈甯和合作者闡述了細菌利用 Cascade-TniQ 複合物來識别靶 DNA 的機制[4]。
上述工作揭示了細菌 CRISPR-Cas 免疫系統抵禦外源核酸入侵的分子機制。憑借這些工作，她在博後期間獲得了美國布拉瓦尼克區域青年科學家化學獎。
如今，她回到國内任職已有兩年之久。未來其将繼續研究包含 CRISPR-Cas 系統在内的新型細菌免疫系統的分子機制，力争更好地助力于開發相應的生物技術工具，最終将其用于臨床疾病檢測與治療。
參考資料：
1.Cui, N., Zhang, J. T., Liu, Y., Liu, Y., Liu, X. Y., Wang, C., ... & Jia, N. (2023). Type IV-A CRISPR-Csf complex: Assembly, dsDNA targeting, and CasDinG recruitment. Molecular Cell.
2.Mol. Cell, 2019a, 2019b, 2019c
3.Science, 2020
4.Cell Res., 2020