熒光染色法評價馬鈴薯胞囊線蟲的生活力
前言：馬鈴薯囊腔線蟲（Potato cyst nematodes，簡稱PCNs）包括Globodera pallida和Globodera rostochiensis，在全球範圍内對馬鈴薯生産和農場門口收入造成嚴重損害，并且屬于檢疫性害蟲。準确評估PCN卵的存活能力對于根除和管理計劃至關重要。本研究的目标是開發一種快速可靠的熒光染色方法，用于評估G. pallida和Globodera ellingtonae卵的存活能力。通過與傳統的Meldola's Blue（MB）染色法對比，評估了八種熒光染料對G. pallida卵的染色效率。熒光染料對于非活性卵的染色效率從80.33% ± 2.99（Sytox Green）到100%（Acridine Orange）不等。
使用兩種Globodera物種，即G. pallida和G. ellingtonae。從Idaho産地的G. pallida在兩種不同的易感馬鈴薯品種Desirée或Russet Burbank上飼養的五個不同溫室産地（A-E）中提取了囊腔。在感染和種植後16周，使用浸泡器從土壤中提取囊腔，然後将收獲的囊腔儲存在4°C直到實驗使用。對G. pallida囊腔進行了形态學和分子學物種确認。Globodera ellingtonae囊腔由Inga Zasada博士（美國農業部農業研究局，俄勒岡州科瓦利斯）提供。
使用八種不可透過細胞的熒光染料，即Acridine Orange（AO）、Laser Dye Styryl 751（LDS 751）、SYTO Orange 81、SYTO Orange 82、SYTO Orange 83、SYTO Orange 84、SYTO Orange 85和Sytox Green來評估PCN卵的存活能力。所有熒光染料均購自美國俄勒岡州尤金市的Thermo Fisher Scientific公司。用于評估熒光染色方法的活性染料Meldola's Blue（8-二甲氨基-2,3-苯并惡噻吩半（氯化鋅）鹽）由美國紐澤西州新不倫瑞克的Spectrum Chemical公司采購。
染色卵的檢查使用配備金屬鹵素燈（Lumen 200熒光照明系統，Prior Scientific Inc.，美國馬薩諸塞州羅克蘭市）光源的Leica DMi8熒光顯微鏡（Leica microsystems CMS GmbH，德國韋茨拉爾）。用于可視化不同染料的不同熒光發射最大值的是手動濾光筒，其中包括4',6-二氨基-2-苯并吲哚，二鹽酸鹽（DAPI）（Ex: 390/70-DC: 455-EM: 470）、異硫氰酸熒光素（FITC）（Ex: 470/40-DC: 495-EM: 525/50）、羅丹明（Ex: 546/10-DC: 560-EM: 585/40）和Y5（Ex: 620/60-DC: 660-EM: 700/76）。Meldola's Blue染色的卵在明場下分析。
熒光資料由Thermo Fisher Scientific公司的焦點檢測熒光顯微鏡測試片校準。照片在黑暗的房間内以5×、10×或20×放大倍數使用Leica DFC 450數位相機拍攝，并使用Leica Application Suite（LAS）軟體處理。
去掉上清液，将卵重新懸浮在1.5毫升GenPure水中。對于AO和LDS 751，使用4種不同濃度的染料：5、10、25和50微克/毫升；對于SYTO Orange 81-85和Sytox Green染料，使用5、10、25和50微克/毫升的濃度。所有染料稀釋使用無菌GenPure水進行。為了優化染料，G. pallida卵使用改進的方法進行熱殺死。釋放的卵在加熱塊上進行2小時的70°C熱處理，然後在冰上冷卻，然後進行染色。
結論：SYTO系列熒光染料在結合核酸後顯示450至1000倍的熒光增強效應，廣泛用于測定各種細胞系的存活/凋亡。SYTO染料具有較高的染色效率，可用于實驗室條件下評估PCN的存活能力。
SYTO染料的低細胞毒性可能在後續處理（如孵化測定）中具有優勢。與其他熒光染料相比，SYTO染料的一個缺點是對存儲條件的敏感性。使用Sytox Green染料進行熒光染色和流式細胞儀分選G. pallida時觀察到卵的存活率随着孵化時間的增加而增加。
