文：回溯檔案
編輯：回溯檔案
植物的所有氣生器官均源自莖尖分生組織（SAM），它是農作物地上生物量來源的基礎，器官的原基産生于SAM的外圍，并在營養生長階段發育成葉，或在生殖生長階段發育成花 。
在雙子葉被子植物中，SAM可分為三個區：中央區（CZ）、組織中心（OC）和外圍區（PZ），中心區包含三層（L1-L3）多能幹細胞。CZ正下方是OC，這是一個帶有調節幹細胞維持信号的分區。
來自CZ的子細胞橫向轉移到PZ中，在那裡它們增殖并最終在器官發生過程中分化，III類同源域亮氨酸拉鍊(HD-ZIPIII)轉錄因子(TF)家族是植物界所獨有的；它在調節胚胎模式、分生組織形成、器官極性、血管發育和分生組織功能中發揮着重要作用。
對HD-ZIPIII家族成員功能缺失等位基因的研究表明，REV基因的缺失會導緻頂端和腋生分生組織發育明顯缺陷，例如缺乏腋生分生組織、分枝減少、花結構發育不全甚至不育。rev /phb/phv三重突變體顯示出增強的缺陷表型。
表明REV、PHB和PHV在調節SAM形成中的功能備援。ATHB8和CAN在某些組織中拮抗REV，但在其他組織中與REV重疊。
棉花（Gossypiumhirsutum）是一種重要的經濟作物，具有不确定的生長習性，為了平衡其營養生長和生殖生長，中國棉花生産過程中經常對主莖進行人工打頂（去除生長尖）。
然而由于近幾十年來勞動力減少和勞動力成本上升，迫切需要開發更高效的技術，例如生物打頂，以取代手工打頂，在本研究中，我們克隆并鑒定了棉花中AtREV基因的四個同源物（GhREV1、GhREV2、GhREV3和GhREV4）。
并發現GhREV2是SAM發展的關鍵調節因子。這些結果為開發控制棉花主莖生長的生物措施提供了線索。
植物材料和生長條件
本研究使用陸地棉cvCCRI41和Xinshi17進行農杆菌介導的病毒誘導基因沉默(VIGS)和定量實時聚合酶鍊反應(qRT-PCR)測定，種子在沙子中發芽，4天後轉移到裝有5LHoagland溶液的盆中（每盆12株幼苗）。
實驗在溫室中進行，溫度為24±2°C（白天）/20±2°C（夜間），相對濕度為60%，光照強度為400μmol·m−2·s−1，光照周期為14h（亮）/10h （暗）。
營養液每4天更換一次。拟南芥幼苗在22°C、相對濕度60%、80μmol·cm −2 ·s −1的培養箱中生長用于原生質體瞬時測定的14小時（光）/10小時（暗）光周期的光。
蛋白質系統發育樹和序列分析
中的基本局部比對搜尋工具(BLAST)搜尋棉花中的HD-ZIPIII同源物，下載下傳相應的氨基酸序列，使用MEGA5中的鄰接方法建構了棉花和拟南芥中HD-ZIPIII同源物的系統發育樹，進行序列比較分析。
RNA提取和qRT-PCR
收集棉花幼苗樣品，用于第六葉期GhREV的組織特異性表達。VIGS-GhCLA1植物顯示第一片和第二片真葉完全漂白後，收集VIGS處理棉花的芽尖樣品。樣品立即冷凍在液氮中并儲存在-80°C。
使用植物RNA快速提取試劑盒從樣品中分離總RNA，然後反轉錄成cDNA，通過qRT-PCR檢測植物中GhREVs、GhWUS10A和GhSTM的表達。
轉錄活性測定
效應子和報告子建構體用于檢測GhREV的轉錄活性。該報告基因包括四個拷貝的GAL4上遊激活序列(UAS)、一個最小的35S啟動子（包括TATA盒）和一個熒光素酶報告基因。
效應器包含GAL4DNA結合結構域與AtDB5或AtWRKY29（陽性對照）或受35S啟動子控制的單個GhREV，使用Nco I和Stu進行限制性内切酶克隆，将GhREV1、GhREV2、GhREV3和GhREV4克隆到GAL4載體中我分别。
添加UBQ10-GUS作為轉染效率的内部對照，孵育12h後，用酶标儀檢測熒光素酶報告基因的活性。
亞細胞定位
GhREV2蛋白的亞細胞定位是在拟南芥原生質體中進行的，使用Sma I和Kpn通過限制性内切酶将GhREV2的全長cDNA克隆到pSuper1300載體中，以生成pSuper:: GhREV2-GFP，将融合的建構體轉化或共轉化到原生質體中12小時。通過共焦顯微鏡檢查熒光。
擴增GhREV2的330bpcDNA片段并克隆到pYL156載體中，通過電穿孔将二進制TRV載體pTRV: RNA1和pTRV: RNA2 的質粒轉化至根瘤農杆菌菌株GV3101中，如先前所述，培養農杆菌菌株用于VIGS測定，使用無針注射器将農杆菌菌株的混合物滲透到兩個完全展開的子葉中。
資料通過獨立重複進行彙集。使用單因素方差分析(ANOVA)進行統計分析，并使用Duncan多重範圍檢驗比較處理平均值，P <0.05。
HD-ZIPIII家族的系統發育分析
拟南芥中的HD-ZIPIII家族已得到很好的表征，拟南芥中HD-ZIPIII家族成員的完整氨基酸序列被用作對陸地棉國家生物資訊(NBI)蛋白質資料庫進行BLAST分析的查詢。
系統發育分析顯示棉花中有18個推定的HD-ZIPIII成員，包括8個AtREV旁系同源物、4個位于D亞基因組的基因和其他4個位于A亞基因組的基因。
此外，每個GhREV與拟南芥有超過82%的氨基酸同一性和90%的cDNA序列相似性修訂版，由于A亞基因組和D亞基因組高度相似，RT-PCR無法區分GhREVsA和GhREVsD。
是以，在接下來的工作中， 我們将GhREVsA/D分别命名為GhREV1、GhREV2、GhREV3和GhREV4。
GhREVs基因的時空表達模式
基因的表達水準往往與其生物學功能相關，從子葉期和第2、4、6、8葉期的棉苗中提取根、莖、葉和莖尖的總RNA ，進行定量實時PCR(qRT-PCR)以确定GhREV的時間和空間轉錄表達模式。
結果顯示，GhREV基因在所有測試組織中都有表達，在莖和SAM中表達較高，GhREV2和GhREV4的表達水準高于GhREV1和GhREV3在根、葉和SAM中。
而莖除了GhREV2和GhREV4之外還擁有更多的GhREV3轉錄本中的時間表達模式，從子葉階段到第6葉或第8葉 階段沒有明顯的差異，對于莖，我們觀察到GhREV2和GhREV4的表達水準在第4葉期達到峰值， 而GhREV3在第8葉期達到峰值。
GhREV2和GhREV3作為轉錄激活劑
為了确定GhREV是否具有轉錄活性，我們進行了基于拟南芥原生質體的反式激活測定，與陰性對照相比，GhREV2和GhREV3顯着激活了熒光素酶報告基因。GhREV2的激活活性與AtWRKY29相似。
為了确定亞細胞定位，将GhREV2與綠色熒光蛋白(GFP)的C末端融合并轉化到拟南芥原生質體中，空的GFP建構體由花椰菜花葉病毒35S啟動子驅動，并在原生質體的細胞質、細胞核和質膜中表達，僅在細胞核中觀察到 源自GhREV2-GFP建構體的熒光信号。
GhREV2沉默導緻棉花SAM發育缺陷
為了表征GhREV2的功能，我們通過基于煙草脆裂病毒(TRV)的VIGS系統在棉苗中沉默了它，植物顯示白化表型後，使用qRT-PCR評估相對表達水準。
資料顯示，由于GhREV基因的高度相似性，與對照相比，不僅GhREV2而且GhREV1、GhREV3和GhREV4都被沉，GhREVs的沉默效率均超過55%。
與拟南芥中的AtREV類似，GhREV在棉花的多種組織中表達，我們推測GhREV還可能參與維管束的形成、葉極性的建立以及SAM的分化，SAM中GhREV2和G hREV4的表達顯着高于G hREV1和G hREV3，表明G hREV2和G hREV4可能主要在莖尖的發育中發揮作用。
此外，雙熒光素酶報告基因測定顯示隻有GhREV2和GhREV3具有轉錄活性。基于時空表達模式，GhREV3可能作為莖中的正轉錄因子來調節維管組織的發育。
而GhREV2可能在調節SAM中發揮主要作用。盡管在所有測試組織中GhREV4的表達水準均高于GhREV1和GhREV3，但它并不充當轉錄激活因子，此外GhREV2位于細胞核中，正如其TF功能所預期的那樣。
由于GhREVs的高度同源性，GhREV2的沉默也在一定程度上降低了其他家族成員的表達水準，然而轉錄活性測定表明，隻有GhREV2和GhREV3具有轉錄活性，并且GhREV3在SAM中的表達較少，是以我們推測GhREV2在控制SAM的發育中起主要作用。
廣泛的分子遺傳學研究已經确定了跨物種SAM過程中起作用的關鍵調節因子和網絡，衆所周知，WUSCHEL(WUS)TF的同源結構域對于植物SAM幹細胞的維持至關重要。
WUS在OC中表達，然後進入CZ并激活CLAVATA3（CLV3）的轉錄。反過來，CLV3可以抑制WUS表達，這些事件形成負回報循環，保證SAM中幹細胞生态位的動态大小調整。
此外，SHOOTMERISTEMLESS(STM)是KNOX家族的成員，它通過抑制CZ中器官形成因子ASYMMETRICLEAVES1 ( AS1 )和AS2的表達來防止幹細胞分化，STM的突變可導緻莖和分生組織提前終止。
這與WUS-CLV3途徑平行，重要的是據報道，HD-ZIPIII家族，包括REV和PHB，可以與B型拟南芥反應調節器（ARR）強烈互相作用以激活WUS。
在這項研究中，發現GhWUSA10和GhSTM的表達在VIGS -GhREV2植物中被顯着抑制，表明GhREV2可能與GhWUSA10和GhSTM一起發揮作用來調節棉花SAM的發育。
結論
我們在棉花中克隆了AtREV的四個直系同源基因，即GhREV1、GhREV2、GhREV3和GhREV4，所有GhREV在根、莖、葉和SAM中表達。與GhREV1和GhREV3相比， GhREV2和GhREV4在SAM中的表達水準較高。
然而，隻有GhREV2具有轉錄活性，GhREV2定位于細胞核；通過病毒誘導基因沉默（VIGS）使其沉默，産生異常的SAM，兩個關鍵基因， GhWUSA10和GhSTM參與調節植物SAM發育的GhREV2在VIGS -GhREV2植物中的轉錄本減少了約50%。
本研究的結果表明，GhREV2可能通過調節GhWUSA10和GhSTM的轉錄本對棉花SAM的發育産生積極影響，GhREV2通過潛在地調節GhWUSA10和GhSTM來積極調節棉花SAM的發育 。
參考文獻
【1】AsaiT、TenaG、PlotnikovaJ等人。拟南芥先天免疫中的MAP激酶信号級聯。自然。2002；415(6875):977。
【2】BaimaS、NobiliF、SessaG等。ATHB-8同源盒基因的表達僅限于拟南芥中的原維管細胞。發展。1995；121(12)：4171-82。
【3】布斯塔曼特M、馬圖斯JT、裡希曼JL。用于剖析莖尖分生組織中基因調控網絡的全基因組分析。J實驗機器人。2016；67(6)：1639–49。
【4】伯恩我。芽分生組織功能和葉極性：III類HD-ZIP基因的作用。公共圖書館基因。2006；2(6)：e89。
【5】GaillochetC，LohmannJU。永無止境的故事：從多能性到植物發育可塑性。發展。2015；142(13)：2237–49。