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CAR-T細胞療法的誕生，改變了很多白血病患兒的命運。
然而，CAR-T細胞治療的效果難以預測。有些患兒治療後病情長期緩解，甚至實作了臨床治愈；更多的患兒卻因為CAR-T細胞消失等原因，癌症很快就卷土重來。
雖然已經有研究發現，CAR-T細胞的持久性與治療效果密切相關[1]，但是科學家和醫生對能持續存在的CAR-T細胞的特征知之甚少。
去年年初，賓夕法尼亞大學Carl H. June團隊分析了兩名緩解超過十年的慢性淋巴細胞白血病（CLL）成人患者的CAR-T細胞，發現最後持續存在的居然是一群具有細胞毒性的CD4+CAR-T細胞[2]。不過，這個研究樣本量較小，其他類型患者是否存在類似情況仍未可知。
近日，由英國倫敦大學學院大奧蒙德街兒童醫院Sara Ghorashian和桑格研究所Sam Behjati領銜的研究團隊，在著名期刊《自然·醫學》發表了迄今為止最大規模的持久性CAR-T細胞研究[3]，進一步揭示了接受CAR-T治療後獲得持續緩解的患者的CAR-T細胞特征。
值得注意的是，在這一次的研究中，研究人員發現的持久性CAR-T細胞不是CD4陽性的，而是CD4/CD8雙陰性的，這一結論與June團隊的不同，凸顯了持久性CAR-T的複雜性。不過，讓人欣喜的是，兩個團隊在持久性CAR-T細胞中發現了類似的轉錄特征，這一發現或許給研究持久性CAR-T細胞的科學家們留了一扇窗。
論文首頁截圖
接下來，咱們就一起來看看Ghorashian團隊的研究是如何展開的，以及他們發現了什麼。
為了進一步了解持久性CAR-T細胞的特征，Ghorashian團隊使用的是參加了CARPALL試驗的10名R/R B-ALL患兒的CD19 CAR-T細胞樣本。CARPALL研究一開始招募了15名患兒，其中13名患兒實作了完全緩解；這些完全緩解的患兒中有6名随後複發，另外7名被證明實作了長期緩解。
他們從其中10名患兒的血液樣本中獲得了足夠的CAR-T細胞，并根據采樣距離回輸CAR-T細胞的時間，将樣本分為早期（1-3個月，實作完全緩解的時間視窗），中期（4-6個月）和晚期（7-60個月，複發的時間視窗）。然後通過流式細胞儀利用CD3和CAR表達從外周血或骨髓中分離出CAR-T細胞。
患者的疾病情況和研究流程
Ghorashian團隊總共采集了264827個通過品質控制的單細胞，其中約50000個是CAR-T細胞。在分析所有CAR-T細胞表面的标志物之後，他們發現，在大多數情況下，CD8+T細胞都是主要CAR-T細胞；不過，在晚期這個時間點，CAR-T細胞缺乏CD4和CD8A轉錄物的表達。
值得注意的是，在所有時間點上，CD4+CAR-T細胞的占比都很小。彙總來看，那些持續存在的CAR-T細胞主要是CD4/CD8雙陰性T細胞。這一發現與June團隊的截然相反（CD4+CAR-T細胞多，雙陰性T細胞少）[2]。
為了證明上述發現，Ghorashian團隊又擷取了7名獲得持續緩解患兒的外周血（PB）和骨髓（BM）樣本，這些樣本是在晚期時間點收集的（打點滴後7-72個月）。
他們分離并分析這些CAR-T細胞，證明晚期時間點上大多數細胞是雙陰性的。相較而言，在這些患兒的非CAR-T細胞中，雙陰性T細胞比例較低。此外，他們還發現這些持久存在的CAR-T細胞還表現出缺乏CD45RA和CCR7的表達，這表明它們具有效應記憶表型。
基于以上研究資料，研究人員認為，大多數持續存在的CAR-T細胞是雙陰性的αβ T細胞。
不同T動态變化
接下來的問題是，不同患者體内的持久性CD4-CD8-CAR-T細胞在轉錄層面究竟有沒有相似之處，以及與其他時間段的CAR-T細胞有沒有差別呢？
還真有。
Ghorashian團隊用單細胞測序技術，分析了早期、中期和晚期CAR-T細胞，以及輸注前的CAR-T細胞的轉錄組資料，結果發現差異很大，而且晚期持久存在的CAR-T細胞表現出一種相同的轉錄組特征。
轉錄組特征
具體到晚期的持久性CAR-T細胞而言，它們高表達免疫相關基因，如TIGIT和GPR183，以及在免疫生物學中具有未知或新興作用的基因，例如FXYD2、HMOX1、DENND2D和ISG20。
T細胞耗竭标志物TIGIT的出現，吸引了Ghorashian團隊的注意。進一步分析發現，持久性CAR-T細胞确實表達了一些典型的共抑制受體，如HAVCR2和LAG3；PDCD1的表達也小幅上升。此外，與前體耗竭的T細胞（與免疫治療療效有關）類似，晚期CAR-T細胞也有相關效應基因（GZMK和PRF1），以及與T細胞耗竭相關轉錄因子（TOX、NFATC1、BATF和PRDM1等）的表達。
持久性CAR-T細胞雖然表現出耗竭的特征，但并沒有表現出終末分化的特征。此外，持久性CAR-T細胞中JUN的表達很強，JUN可以介導T細胞衰竭的逆轉，以及維持那些具有幹細胞記憶特性的細胞。基于以上結果，研究人員認為，持久性CAR-T細胞具有耗竭樣記憶狀态和獨特的轉錄特征。
不同時期CAR-T細胞的轉錄特征
至于這些持久性CAR-T細胞是不是源于克隆擴增，Ghorashian團隊的研究結果表明，這種功能上的趨同，并不是克隆擴增導緻的，因為在所有的時間點上，CAR-T細胞群在遺傳上是多樣化的，而且沒有證據表明存在一個或多個克隆在晚期的時間點上占主導地位。
尤其值得注意的是，Ghorashian團隊将這種轉錄特征與June團隊的資料做了比對，對比結果出人意料，雖然這兩個研究發現的持久性T細胞存在很大差異（一個是雙陰性的，一個是CD4陽性），但是這兩個研究的持久性CAR-T細胞的轉錄特征卻高度相似。
這種相似性讓Ghorashian團隊懷疑起了這個轉錄特征的普遍性，不過在對來自各種健康組織的T細胞、迄今為止的其他CAR-T研究和癌症細胞單細胞圖譜進行了評分之後，他們打消了這個疑慮，因為沒有找到持久性CAR-T細胞的這種轉錄特征。也就是說，這個轉錄特征是持久性CAR-T細胞所特有的。
不同T細胞的轉錄特征
總的來說，Ghorashian團隊認為，他們這個研究最重要的發現是發現了持久性CAR-T細胞的獨特轉錄特征。而且這個特征在不同人群、不同CAR-T療法中也存在。是以這暗示着，這種獨特的轉錄特征有可能代表了持久性T細胞的通用特征。
未來，本研究發現的轉錄組變化值得展開進一步的探索。如果能取得突破，或許有助于科學家破解持久性CAR-T的謎題，找到讓CAR-T細胞持續存在的方法，更好地治療各種癌症。
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參考文獻：
[1].Finney OC, Brakke HM, Rawlings-Rhea S, et al. CD19 CAR T cell product and disease attributes predict leukemia remission durability. J Clin Invest. 2019;129(5):2123-2132. doi:10.1172/JCI125423
[2].Melenhorst JJ, Chen GM, Wang M, et al. Decade-long leukaemia remissions with persistence of CD4+ CAR T cells. Nature. 2022;602(7897):503-509. doi:10.1038/s41586-021-04390-6
[3].Anderson, N.D., Birch, J., Accogli, T. et al. Transcriptional signatures associated with persisting CD19 CAR-T cells in children with leukemia. Nat Med, 2023. https://doi.org/10.1038/s41591-023-02415-3
本文作者丨BioTalker