水凝膠具有類似于細胞外基質的理化性質，具備良好力學性能、自愈合能力和響應性，可用于建構組織再生的微納米仿生結構，并提供微米尺度的表面形态來調節細胞行為，如細胞粘附、遷移或生存增殖分化因子的釋放。是以，水凝膠被廣泛應用于組織工程和藥物遞送等領域。然而，制備高精度的三維（3D）任意生物相容性水凝膠支架頗具挑戰性。為了适應未來生物醫學領域的發展，亟需開發具有精細3D幾何結構的新型水凝膠材料。
近日，中國科學院理化技術研究所仿生智能界面科學中心有機納米光子學實驗室研究員鄭美玲團隊在《ACS應用材料與界面》（ACS Applied Materials & Interfaces）上，發表了題為22 nm Resolution Achieved by Femtosecond Laser Two-Photon Polymerization of a Hyaluronic Acid Vinyl Ester Hydrogel的研究成果。該研究提出了真3D高精細任意可設計拓撲結構調控單細胞的新政策。
科研人員采用飛秒雷射雙光子聚合技術，以乙烯基酯透明質酸（HAVE）水凝膠作為單體材料，P2CK作為高效水溶性雙光子引發劑，二硫蘇糖醇（DTT）作為硫醇-烯點選化學交聯劑和PBS緩沖溶液配制了HAVE前驅體，通過配方優化和雷射焦點調控在水凝膠結構分辨率上取得了重要進展即最高分辨率達22 nm，制備了與細胞尺寸相當的水凝膠3D微支架并驗證了材料與結構的生物相容性，表明HAVE水凝膠細胞支架可進一步用于研究細胞遷移和操作等行為。
該團隊開展了配方優化實驗，通過改變單體和引發劑的品質比及控制硫醇-烯官能團比例篩選出溶解性好、易于加工和聚合性能良好的HAVE前驅體配方。
在幾十納米尺度的分辨率中，體素相對于基底的位置是不可忽略的影響因素。為了進一步提高結構分辨率，該團隊根據雷射焦點體素理論調控焦點與基底相對位置進而獲得更高分辨率的線結構。如圖2所示，大功率雷射焦點光斑明亮，且體素體積較大，不易得到最佳焦點位置，而小功率雷射焦點光斑較弱，體素體積更小，更易獲得最佳焦點位置，基于此方法獲得了更高分辨率的線結構。
通過上述配方優化和焦點調控，科研人員開展了HAVE前驅體C配方的分辨率研究。當掃描速度為6 μm/s時，線結構的品質得到了顯著提高（圖3a），結構完整緻密。研究利用HAVE前驅體C配方實作了22 nm的分辨率（圖3c）。
進一步，研究對HAVE前驅體配方進行了3D水凝膠微結構的雙光子聚合加工，利用原子力顯微鏡測量了3D細胞支架的楊氏模量，平均值94 kPa接近體内組織的力學性能。研究對配方中水溶性引發劑P2CK和3D細胞支架進行了生物相容性測試，驗證了該材料和結構具有良好的生物相容性。
綜上，該團隊全面研究了HAVE水凝膠光刻膠的雙光子聚合性能，通過優化光刻膠前驅體的配方和調節焦點位置獲得了22 nm的特征線寬，并驗證了材料和3D水凝膠細胞支架的生物相容性。本研究提出的方案，有望建立複雜的生物相容性3D水凝膠結構，并探索其在個性化微環境調控、組織工程、生物醫學和仿生科學領域的潛在應用。
上述成果是該團隊前期一系列仿生水凝膠工作的拓展。研究工作得到國家重點研發計劃“納米科技”重點專項、國家自然科學面上基金、中國科學院國際夥伴計劃等的支援。
圖1.3D水凝膠的制備示意圖
表1 A-E系列HAVE前驅體配方優化及性能比較
圖2.體素形态和相對基底位置對大功率變化（a）和小功率變化（b）聚合線結構分辨率的影響
圖3.HAVE前驅體C配方雙光子聚合性能研究
圖4.A和C配方制備的3D細胞支架結構的SEM對比圖以及水凝膠支架上共培養L929細胞的共聚焦熒光顯微鏡圖像
來源：中國科學院理化技術研究所
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