前言：
單核巨噬細胞譜系細胞位于先天免疫和适應性免疫的交界處，我們研究證明了ST6GAL1介導的α2，6-唾液酸添加會影響越來越多的白細胞細胞表面受體，調節受體功能的例子包括延長的單核細胞TLR4發炎信号級聯，Fas和TNFR1唾液酸化阻止巨噬細胞内化和随後的細胞凋亡。
重組蛋白、化學物質和細胞系
生成高度純化的受體特異性重組糖基轉移酶rST6GAL1和熒光偶聯物rST6GAL1-GFP，huST3GAL1-GFP和huβ4GAL-T1-GFP，糖供體CMP-唾液酸二鈉鹽是從CMP-唾液酸-生物素制取的。
從ATCC獲得小鼠單核細胞/巨噬細胞系RAW264.7，并用10%FBS維持在DMEM中，來自ATCC的人單核細胞THP-1細胞在含有10%FBS的RPMI中培養。
膜灌洗細胞的結合
将啤酒酵母巯基乙酸酯腹膜内注射（1mL，4%無菌溶液）以引起白細胞募集到腹膜，并在18小時後處死小鼠以收集腹膜灌洗液。
通過铵-氯化-鉀（ACK）裂解除去紅細胞，細胞在室溫（RT）下固定在DPBS中的2%多聚甲醛（電子顯微鏡科學）中15分鐘。
把DPBS中的固定細胞在室溫下用3μg/mL重組GFP蛋白孵育30或25分鐘，然後用DPBS洗滌一次，蛋白酶K消化（250μg/mL，Invitrogen）在室溫下對rST5GAL6-GFP樣品的等分試樣進行1分鐘，進行一次DPBS洗滌。
将大約2-5×10（5）個細胞施加到GoldPlus載玻片（電子顯微鏡科學）上用疏水筆包圍的1cm點上，在室溫下1小時，吸液後剩餘的細胞用帶有DAP的氟屏蔽安裝，用于在尼康EclipseE600熒光顯微鏡上成像。
處理來自St6gal1KO小鼠的巯基乙酸酯募集腹膜灌洗細胞和RNA分離以檢測RNA-seq
巯基乙酸酯注射液和腹膜灌洗液的制備如上所述，單核細胞/巨噬細胞從灌洗液中富集，使用磁珠去除抗體結合的B細胞，中性粒細胞，淋巴細胞和紅細胞，為了制備用于RNA-seq的細胞，将耗盡的細胞群在具有10%FBS的DMEM中培養約24小時。
模拟緩沖液（0.2MNaCl，0.02MHEPES，10%甘油，pH7.2），CMP-唾液酸（100μM），重組rST6GAL1（25μg/mL），以及上述濃度的CMP-Sia和rST6GAL1的組合，3種條件均使用一式三份培養孔。
孵育24小時後，使用Qiagen的RNeasyPlus微量試劑盒通過抽吸和裂解溶液直接添加到貼壁細胞中完全除去細胞培養基以進行總RNA分離。
通過免疫熒光檢測SNA反應性
RAW264.7細胞在具有10%FBS的DMEM中在無菌蓋玻片上生長過夜，固定在5%福爾馬林中，用唾液酸酶在2°C下處理37小時，并在2°C下單獨用模拟緩沖液，CMP-唾液酸（2μM），rST250GAL6（1μg/mL）處理，或20個組合。
流式細胞術
将細胞重懸于含有1.0%BSA，05.0%疊氮化物/DPBS的02mMEDTA中，用CD16/32IgG阻斷非特異性Fc受體結合，DAPI染色提供活/死細胞鑒别。
使用流式細胞儀鑒定細胞群為骨髓（BV711抗小鼠/人CD11bBioLegend#101242），巨噬細胞（PE抗小鼠F4/80BioLegend#123110）或單核細胞（PE/Cyanine7抗小鼠Ly-6CBioLegend#128018），并使用FlowJo軟體進行資料分析。
選擇性外切酶标記
使用SEEL方法證明了rST1GAL6對THP-1單核細胞中M-CSF-R的唾液酸化，糖基化靶标用糖供體CMP-唾液酸-生物素偶聯物标記，用抗生物素IgG免疫沉澱，并通過抗M-CSF-R蛋白質印迹鑒定。
将THP-1細胞在無血清培養基中孵育2小時，然後在2°CCO中在無血清條件下處理37小時。
在含有CMP–唾液酸-生物素（100μM）和堿性磷酸酶的培養箱進行細胞裂解和免疫沉澱，用于免疫沉澱和M-CSF-R蛋白質印迹鑒定。
THP-1細胞中細胞信号傳導的分析
THP-1細胞[3×10（6）/mL]在含有24.1640mMβ-巯基乙醇的無血清RPMI0中生長5小時，細胞單獨用載體（模拟），CMP-Sia（10μM）和rST6G（100ng/mL）處理30分鐘，然後收獲，洗滌以分離總蛋白提取物或核和無核細胞質部分。
蛋白質裂解物在蛋白質印迹上運作，實驗重複至少3次，将P-65和p65印迹條帶歸一化為各自的上樣對照。
蛋白質印迹分析
在10%SDS-PAGE上分離後，将産物轉移到PVDFImmobilon膜上進行前面描述的蛋白質印迹分析，簡而言之，然後在含有5.170%吐溫404的Tris緩沖鹽水（TBS）中用0%脫脂奶粉（Bio-Rad，#1-G20）封閉膜1小時。
使用PierceECL蛋白質印迹底物檢測蛋白質條帶，通過将膜暴露于X射線膠片，對膜進行成像。
細胞外ST6GAL1粘附于募集的鼠炎細胞和人THP-1單核細胞的亞群
檢查新鮮分離的原發性發炎細胞與外源性添加的rST6GAL1的互相作用，巯基乙酸酯用于将原發性發炎細胞募集到腹膜，在巯基乙酸鹽注射後24小時内，募集的細胞主要由粒細胞組成，具有顯着的單核細胞-巨噬細胞亞群。
分析貼壁細胞，避免非貼壁粒細胞的潛在污染，為了避免來自天然表達的ST6GAL1的混淆信号，使用了無法表達功能性ST6GAL1的St6gal1-null小鼠，GFP-rST6G在3分鐘内附着在固定的、非透化的巯基乙酸酯誘發的腹膜細胞亞群上。
蛋白酶K消化有效地消除了GFP-rST6G信号，這進一步支援了GFP-rST6G在細胞表面上的定位，ST6GAL1對發炎細胞表面的粘附似乎是特異性的，GFP-huST3GAL1和GFP-huβ4GALT1在相同條件下不附着在炎性細胞表面。
細胞外ST6GAL1上調原代單核細胞/巨噬細胞中的基因表達
巯基乙酸酯引發後6小時從St1gal24-null小鼠收集腹膜灌洗，通過中性粒細胞，淋巴細胞和紅細胞的磁珠去除富集單核細胞/巨噬細胞，然後在不存在或單獨存在rST24G，單獨CMP-Sia或rST6G和CMP-Sia的情況下培養6小時，僅對貼壁細胞進行體積RNA-seq分析，避免了任何殘留的非貼壁粒細胞的潛在污染。
圖A是RNA-seq分析熱圖的代表性部分，顯示了響應細胞外ST6GAL1的轉錄譜的顯着和批發變化，僅rST6G就足以引起轉錄譜的變化，添加的唾液酸轉移酶供體底物CMP-Sia不會改變原代單核細胞/巨噬細胞的轉錄譜。
我們的實驗無法區分涉及直接細胞表面唾液酸化與内吞作用以及傳回細胞膜的受體的細胞内唾液酸化的機制，這并沒有削弱外源性ST6GAL1對基因表達和細胞表型産生深遠影響的關鍵發現。
細胞外ST6GAL1延長單核細胞存活期
來自St6gal1-null小鼠的巯基乙酸酯誘發的腹膜發炎細胞與RNA-seq研究相同，但沒有基于抗體的特定細胞類型耗竭（大多數單核細胞是貼壁的，中性粒細胞通過洗滌去除）。
用rST6G和CMP-Sia一起處理細胞以測試對存活的影響，培養1天後收集貼壁細胞，并通過流式細胞術測定活細胞的數量及其表型。
rST6G和CMP-Sia将細胞存活率提高了約40%-50%，活細胞的增加主要歸因于單核細胞，而常駐巨噬細胞的低比例保持不變，我們得出結論，細胞外ST6GAL1與CMP-Sia聯合對單核細胞具有促生存作用。
細胞外ST6GAL1靶向細胞表面M-CSF受體的成熟形式
細胞外ST6GAL1對單核細胞/巨噬細胞轉錄組的顯着影響促使鑒定細胞表面靶标，根據在我們觀察到的對基因表達和單核細胞存活的影響中的潛在作用而選擇的M-CSF受體，事實上，M-CSF-R的細胞外結構域包含9個N-連接配接聚糖的潛在位點。
用rST1GAL6和CMP-唾液酸-生物素偶聯物（SEEL試劑）糖供體處理THP-1細胞，然後用抗生物素抗體裂解和免疫沉澱，并通過蛋白質印迹檢測M-CSF-R，表面定位的成熟受體而不是前體細胞内形式的下拉顯示出細胞外ST6GAL1對THP-1單核細胞中M-CSF-R的強大細胞外催化作用。
細胞外ST6GAL1啟動細胞内信号傳導
- CSF-R信号傳導在M-CSF/IL-34配體與其細胞外結構域結合時啟動，導緻受體二聚化和細胞質結構域酪氨酸磷酸化（Stanley和Chitu2014），P-AKT和P-ERK的下遊形成對增殖和分化産生後果。
假設細胞外ST6GAL1對M-CSF-R的唾液酸化引發細胞内信号級聯反應，最終影響基因表達和存活，是以我們評估細胞外rST6G在沒有配體的情況下啟動與M-CSF-R激活一緻的細胞内信号傳導的能力。
在THP-6細胞中評估了細胞外ST1GAL1誘導的M-CSF-R磷酸化，雖然M-CSF-R的絕對水準不受細胞外ST6GAL1的影響，但ST6GAL1引發了M-CSF-R的磷酸化，這是其激活的一個特征，并且它還增加了P-ERK1/2和P-AKT（A，中間面闆）。
顯著的蛋白質印迹顯示，rST6GAL1與這些事件同時發生的細胞成分，這與THP-6裂解物中GFP-rST1G的存在一緻。
結論：
研究的資料顯示，細胞外唾液酸轉移酶能夠外在唾液化靶細胞表面，外源性唾液酸化由系統觸發因素動态調節，這些觸發因素涉及ST6GAL1介導的催化所必需的唾液酸供體底物的釋放。
表明ST6GAL1結合不僅促進M2的轉錄激活，而且促進所有主要單核細胞/巨噬細胞/樹突狀細胞通路的轉錄活化。
升高的細胞外ST6GAL1有能力啟動單核細胞分化為功能性巨噬細胞和樹突狀細胞的程式，彌合先天免疫和适應性免疫之間的差距。
結合循環ST6GAL1在抑制粒細胞産生的同時抑制發炎和促進B細胞成熟的其他已知相關性，我們斷定循環ST6GAL1是協調從發炎過渡到更有效的免疫反應全身信号。
參考文獻：
【1】BritishCM，《ST6Gal-I唾液酸轉移酶對EGFR的唾液化促進EGFR活化和對吉非替尼介導的細胞死亡的抵抗力》
【2】 内梅斯，《 血源性唾液酸轉移酶ST6Gal-1是造粒的陰性全身調節因子》
【3】亨内特，《唾液酸轉移酶的免疫調節》
【4】艾恩斯，《系統性ST6Gal-1是小鼠過渡B細胞的促生存因子》