文|浮生
編輯|浮生
前言
在許多生物中，通過基因沉默或編輯已經成功地抑制了特定的基因功能，然而，使用細胞毒素基因還沒有實作抑制靶組織功能的遺傳操作。在這裡我們建立了具有後部絲腺(PSGs)的轉基因蠶，其表達細胞毒素pierisin-1A (P1A)的酶結構域，以此來驗證通過靶向P1A表達的新方法可用于開發具有組織特異性功能障礙的生物學有用的模式生物。
截短的P1A在家蠶PSG中的表達和生理影響
白菜蝶衍生的P1A與凋亡誘導體液蛋白Pierisin-1有75%的氨基酸相同，體外翻譯的P1A蛋白表現出ADP核糖基化活性，表現為底物[32P]NAD的ADP核糖基轉移到DNA上；然而，反應産物的HPLC分析顯示，與pierisin-1相比，P1A的DNA ADP核糖基化活性為5%∼（P < 0.001）。
用載體進行轉染實驗，然後用免疫印迹法證明P1A的N端部分含有DNA ADP核糖基轉移酶結構域（P1A269）在昆蟲培養的細胞系，即B. mori衍生的BM-N和Spodoptera frugiperda衍生的Sf21中瞬時表達。
P1A269和全長P1A的異位基因表達對BM-N細胞造成了獨特的非凋亡效應，其特點是扁平細胞數量的增加和報告蛋白合成的抑制。
為了探索細胞内表達的P1A269在特定組織中的功能後果，我們産生了轉基因蠶系w1-pndP1A269/P1A269，它攜帶一個均勻的轉基因，在纖維蛋白重鍊（FibH）啟動子控制下表達P1A269，這在PSG中特别活躍。P1A269的作用預計僅限于PSG，因為它被設計成既缺乏P1A從PSG細胞分泌所需的信号序列，又缺乏其侵入靶細胞所需的C端受體結合域。
反向PCR和DNA資料庫分析顯示，該轉基因被插入到16号染色體中，通過使用免疫印迹和SDS/PAGE，表達的P1A269蛋白可以在第五齡的第6天在幼蟲PSG中檢測到，這與從環狀病毒多面體包被的P1A269和表達P1A269的Sf21和BM-N細胞分離的對照樣品相似。
在幼蟲階段，P1A269的蛋白表達在第四齡的第4天和第五齡的第3和第6天增加，但在第五齡的第7天減少。定量RT-PCR也顯示，P1A269的mRNA表達在第五齡期的第3天和第6天增加。
從w1-pndP1A269/P1A269幼蟲中解剖出來的PSG并沒有因細胞凋亡而消亡，而是表現出形态上的異常，如與未轉化的w1-pnd+/+幼蟲的PSG相比出現凹陷。在本研究中，w1-pndP1A269/P1A269的五齡幼蟲在五齡的第6天開始旋轉，并在第7天進行腸道清洗後繼續劇烈旋轉。
以前的研究表明，在第五齡期的第3天和第五齡期的後期，PSG中的FibH啟動子活性随着幼蟲分泌的蛻皮激素脈沖而增加。在第四齡期的第4天，本研究中的幼蟲被認為處于蛻皮階段，此時蛻皮激素脈沖會影響某些基因的表達。
是以，P1A269在第四期幼蟲第4天和第五期幼蟲第3天和第6天的表達可能受蛻皮激素分泌的控制，這表明蛻皮激素脈沖在幼蟲發育過程中反複誘導P1A269的表達，而這正是PSG的異常出現的原因。
w1-pndP1A269/P1A269蠶的遺傳性狀
w1-pndP1A269/P1A269幼蟲産生的薄層繭殼比w1-pnd+/+幼蟲産生的繭殼重量少79%（P < 0.001），野生型蠶的繭殼由70%的纖維蛋白[FibH和纖維蛋白輕鍊（FibL）]、25%的絲膠蛋白和其他材料組成。
纖維蛋白是專門由PSG生産的生絲成分，而絲膠是主要由中間絲腺生産的膠狀蛋白，通過将纖維蛋白線包圍并粘在一起促進繭的内聚力。是以，w1-pndP1A269/P1A269幼蟲制作的繭殼重量減少，被認為很可能是由于纖維蛋白含量減少。
梯度凝膠（5-20%）中的SDS/PAGE，然後用FibL特異性抗體進行免疫印迹，顯示FibL和FibH蛋白存在于w1-pnd+/+幼蟲的繭殼中，但不存在于w1-pndP1A269/P1A269幼蟲的繭殼中，其中隻有非纖維蛋白，主要是絲氨酸，可以檢測到（絲氨酸1-4）。
定量RT-PCR分析顯示，相對于w1-pndP1A269/P1A269幼蟲，五齡幼蟲的PSG中FibH和FibL的mRNA水準在相應天數的第5、6和7天強烈下降。事實上，在第五階段的第7天，w1-pndP1A269/P1A269幼蟲的FibH和FibL mRNA水準分别下降到w1-pnd+/+幼蟲FibH和FibL mRNA水準的3.1%和0.9%（P < 0.001）。
相對于w1-pnd+/+幼蟲的細胞質作用A3的水準，同一天w1-pndP1A269/P1A269幼蟲的PSG中的mRNA水準似乎沒有下降。這些結果表明，細胞内表達的P1A269抑制了轉基因蠶的PSG中FibH和FibL蛋白的合成。
雄性和雌性w1-pndP1A269/P1A269蛹在化蛹後第三天的平均重量分别比雄性和雌性w1-pnd+/+蛹的平均重量高1.5和1.3倍（P < 0.001）。
這種額外的重量可能是由于保留了原本用于蛋白質生産的營養資源，特别是纖維素，這是蠶繭紡紗所需要的。事實上，在經典的實驗中，通過手術切除第四和第五星幼蟲的絲腺，會在化蛹前造成多餘的體液氨基酸，如Gly、Thr、Ser和Tyr的積累，而切除整個絲腺的幼蟲未能化蛹，可能是由于存在多餘的氨基酸。
w1-pndP1A269/P1A269蛹在化蛹後沒有表現出明顯的發育缺陷；到目前為止，這些轉基因蠶可以成熟到成年，并産生健康的後代，可以成功繁殖。這些結果表明，保留用于纖維素合成的營養資源似乎并沒有對轉基因蠶産生負面影響。
衆所周知，在第一至第四次蛻皮期間紡出的非繭形絲線可将幼蟲的原腿固定在表面，這種行為對支援幼蟲蛻皮至關重要。
在本研究中，紡制不含纖維素的非繭絲的幼蟲沒有不脫皮的情況。這一結果與Takasu等人的證據一緻，即支援幼蟲蛻皮的野生型蠶的非繭絲幾乎不含纖維素，而是主要由絲膠成分組成，特别是絲膠-2。
P1A269等位基因在家蠶育種中的應用
我們接下來建立了KWP1A269/P1A269品系，将養蠶業使用的商業蠶株（Kinshu x Showa）與w1-pndP1A269/P1A269品系交配，篩選出遺傳标記（EGFP陽性眼）的個體，然後進行連續的同胞交配。該商品蠶品系産生的蠶繭比w1-pnd+/+更重。
由此産生的KWP1A269/P1A269幼蟲産生絲膠繭殼，其中FibL和FibH蛋白通過SDS/PAGE和FibL特異性免疫印迹檢測不到。
此外，KWP1A269/P1A269的繭殼比w1-pndP1A269/P1A269的繭殼重1.7倍（P < 0.001），這一結果表明，将w1-pndP1A269/P1A269品系與蠶遺傳資源資料庫（shigen.nig.ac.jp/silkwormbase/top.jsp）中描述的已知能生産重質繭的儲存品系簡單交配，可用于生産無纖維素的重質蠶繭
絲膠繭可用于制備水凝膠
通過對普通蠶繭的生絲脫膠制備的商業絲膠不能形成水凝膠，因為脫膠過程中的高溫和堿性pH條件導緻蛋白質分解，使絲膠不再能通過SDS/PAGE檢測到。然而，完整的、可溶性的、不含纖維素的血清蛋白，其濃度可通過SDS/PAGE檢測，可以很容易地使用6M LiBr從w1-pndP1A269/P1A269血清蛋白繭中制備。
然後用10%的乙醇孵育1小時後，可以誘導完整的、可溶性的絲裂黴素形成水凝膠，由于提取的低濃度絲膠溶液中纖維素的污染程度很高，是以不可能用同樣的化學方法從野生型蠶繭中獲得不含纖維素的完整絲膠溶液。
完整的可溶性蠶絲蛋白具有與膠原蛋白相似的保濕特性，并能在高達96%的水的溶液中凝膠化，完整的絲膠蛋白溶液在4℃下長期儲存2-3周後會自主形成水凝膠。在4℃下長期儲存後，絲膠蛋白結構的輕微改變似乎足以促進凝膠化；是以，加入乙醇可能加速了這一過程。
我們以前表明，封裝在多面體中的細胞因子的活性，也就是絲膠蛋白微晶，可以在體外和體内環境中長期穩定地維持，并可以緩慢釋放，不斷刺激多種細胞類型的生長和分化。
是以，為了确定絲膠水凝膠是否能作為支架支援細胞生長和分化，我們在絲膠水凝膠上培養小鼠胚胎幹（ES）細胞系EB5，該凝膠上覆寫着含有典型的重組人白血病抑制因子（rhLIF）或加入多面體包裹的LIF的媒體。
在LIF存在的情況下可以保持未分化的EB5細胞可以增殖，形成特征性的圓頂狀菌落，并表達堿性磷酸酶（ALP）。分化的EB5細胞在含有blasticidin的培養基中不能增殖，本研究中所有的培養都使用blasticidin。
在缺乏多面體的絲膠水凝膠上生長的對照培養物或納入空多面體的培養物中，EB5細胞沒有增殖并形成ALP染色的陽性菌落，從生長在對照水凝膠上的細胞中提取的ALP活性在培養後沒有增加。
相比之下，生長在有多面體包裹的LIF的水凝膠上的EB5細胞和生長在有含rhLIF的培養基覆寫的水凝膠上的EB5細胞形成了圓頂狀的ALP陽性菌落，其提取的ALP活性分别比在缺乏rhLIF的培養基中加入空多面體的對照水凝膠上生長的細胞高14倍和18倍（P＜0.005；圖3B）；然而，這兩個實驗組之間沒有明顯差異（P＞0.05）。這些發現表明，隻要有LIF，絲膠水凝膠可以作為支援EB5細胞生長的支架。
實驗結果讨論
本研究産生了轉基因蠶w1-pndP1A269/P1A269，其中PSG表達P1A的DNA ADP核糖基轉移酶結構，命名為P1A269。P1A在家蠶細胞中的成功表達可能是由于其相對于強細胞毒性的Pierisin-1的酶活性較低，後者不能在任何種類的活細胞中表達。
細胞内表達的P1A269誘導了BM-N培養細胞中報告熒光素酶合成的抑制，在瞬時表達P1A269的BM-N細胞中，看到具有特征性扁平形态的細胞數量增加。
是以，BM-N細胞對P1A269的反應似乎與細胞周期停滞有關，并涉及進入靜止期，這與蛋白質合成受損和激活應對DNA損傷的凋亡途徑有關。
同時，P1A269誘導PSG細胞中FibH和FibL mRNA水準的下降，PSG細胞不增殖，但在幼蟲階段體積增長，表明P1A269具有抑制FibH和FibL基因轉錄的功能。
細胞質肌動蛋白A3 mRNA水準沒有因為P1A269的功能而下降，表明P1A269抑制了一些基因的轉錄，包括與引入的P1A269的表達同時啟動的纖維蛋白基因。是以，看來P1A269誘導的對一些基因的抑制可能是PSG細胞生長的原因，并導緻觀察到的形态異常。
P1A269的功能表面上看來是誘導了細胞質肌動蛋白A3 mRNA水準的增加，然而，由于P1A269的功能估計會抑制PSG中rRNAs轉錄率的大幅增加，據報道這與纖維蛋白的合成同時發生，是以最好認為該結果是一個不切實際的，從資料的正常化到P1A269改變的18S rRNA水準出現的數字事件。
到目前為止，在用細胞外的Pierisin-1處理哺乳動物細胞後，沒有觀察到除細胞凋亡外的其他細胞反應，因為Pierisin-1可以進入目标細胞。
是以，隻有細胞内表達的P1A蛋白才有望誘發特征性的細胞反應，包括對細胞蛋白合成的抑制，這表明細胞内表達的P1A N端結構域可以引起位點特異性的非凋亡效應，既不會擴充到鄰近的組織，也不會對個體的發育階段産生影響。
P1A也可以在它誘導蛋白合成抑制的任何細胞中有效。是以，細胞内表達的僅編碼N端酶活性區域的P1A可用于産生具有組織特異性功能障礙的模型生物，适用于各種遺傳操作，包括在哺乳動物的癌細胞中誘導靜止，以及開發用于糖尿病研究的胰島功能受損或免疫系統功能受損的動物模型。
然而，為了将來在其他生物體内應用細胞内表達的部分P1A，我們必須首先了解P1A片段如何通過抑制蛋白質合成而不是誘導細胞凋亡來誘導PSG功能障礙。一種可能性是，細胞中一定水準的DNA ADP核糖基化需要抑制蛋白質的合成，但超過這個水準就會誘發細胞凋亡。
與BM-N細胞相比，P1A269在Sf21細胞中的表達更強烈，在那裡它能刺激其凋亡的細胞死亡，這一觀察支援了這一假設。是以，未來的研究需要調查在PSG中發生的蛋白質合成抑制是否取決于表達的DNA ADP核糖化活性的強度，以及如何通過調節控制P1A269表達的啟動子或引入P1A269的氨基酸突變來調節P1A活性。
這項研究還發現，w1-pndP1A269/P1A269幼蟲紡出的繭幾乎不含纖維素，幾乎完全由絲膠組成。以前的一項研究表明，表達Bcl-2相關的X蛋白的蠶PSG會變得消融，盡管這項研究沒有提出關于繭和化蛹後被操縱個體的發展的資訊。
此外，一份描述轉基因蠶的T7 RNA聚合酶修飾的PSG的單獨報告顯示，FibL和FibH的表達減少但可以檢測到，而另一項研究顯示，轉錄激活劑樣效應核酸酶介導的FibH基因中斷的蠶産生的薄層蠶繭不含FibH，但FibL的水準正常。
Nd蠶株有一個影響絲腺的天然基因突變，産生少量的蠶繭，這些蠶繭有非常多的絲膠和不同比例的纖維素。我們的研究報告使用了一種細胞毒素，導緻抑制PSG功能産生FibH和FibL，以及生産僅由絲膠組成的蠶繭。
結語
通過研究我們可以發現：在未來，可以進行進一步的育種，以産生具有中間絲腺的轉基因蠶，該絲腺可産生包含多面體包裹的細胞因子的絲膠，從中可以制造出無病原體的人工細胞外基質，用于體内外應用。
這些蠶可以在它們的絲腺中産生功能蛋白，可以作為膠原蛋白或其他候選藥物輸送生物材料的有效、廉價的替代品。我們的研究結果表明，通過靶向P1A的表達，生物工程成功地生産出了具有重要應用潛力的生物有用性狀的蠶。
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