Harpin負載殼聚糖納米粒誘導煙草的防禦反應
為了有效控制植物病原體的入侵，大量使用化學農藥和化肥，不僅破壞了環境，而且導緻抗性菌株的産生和産量下降。
通過激發子刺激植物防禦并誘導系統獲得性抗性(SAR)可能是限制病原體進入的一種解決方案。在激發子中，殼聚糖和harpin是衆所周知的觸發植物先天免疫以控制植物疾病。
amylovora是一種引起火疫病的病原體，其對應的基因被命名為hrpN。
HarpinPss是丁香P. syringae pv. hrpZ基因編碼的一個34.7 kDa的胞外蛋白，它在煙草和少數其他植物中浸潤後迅速引起HR。
在增強作物抗病能力的同時，harpin的應用也提高了作物産量。Harpin與病原體特異性噬菌體結合使用，比殺菌劑銅-錳鋅處理更有效地降低了田間番茄細菌性斑疹病的發病率，這表明Harpin蛋白的成本效益和環境友好性。
1. 材料與方法
harpinPss的表達和純化
Harpin的純度通過加載到12% SDS-PAGE上來确定。透析後，使用Amicon濾器(10 kDa切斷，Millipore)濃縮harpin。純化後的harpin用于制備H-CSNP。
殼聚糖納米顆粒(csnp)的制備
将印度Mahtani殼聚糖贈送的醋酸殼聚糖(MW: < 150kda, DD 90%)溶于去離子水中，制得0.1% (w/ v)的殼聚糖溶液。
為了制備納米顆粒，将3.1 ml殼聚糖溶液加入1 ml 0.1% (w/v)的TPP 中，形成CSNP。将TPP加入到含有30 ng/mL harpin的殼聚糖溶液中，在室溫下攪拌得到H-CSNP ，4℃，10000 g離心20 min分離NPs，丢棄上清。
植物反應研究
在培養8 h的溫室中培養蒼耳(200 μE·m-2 ·s-1在24℃)和16小時夜間(28℃)循環在70%的相對濕度(RH)和每隔一天澆水。
以4 ~ 5株煙葉為試驗材料，在5株煙葉的第3葉上分别噴灑4 mL h - csnp、TPP (0.1% w/v)、殼聚糖(0.1% w/v)、harpin (30 ng/mL)和水(對照)。
核凝聚是通過一種膜滲透性染料來檢測的，這種染料與DNA結合，将凝聚的細胞核染成亮點，這是在PCD(4,6-二氨基-2苯基吲哚(DAPI)中觀察到的特征。
用H-CSNP、TPP、殼聚糖、harpin 30 (ng/mL)和水處理4小時後，将葉片浸泡在1µM DAPI和0.5 M蔗糖中5分鐘，在共聚焦顯微鏡(Leica)下觀察，激發波長為365nm，發射波長為450nm。
2.結果與讨論
Harpin是一種具有生物活性的親水分子，富含亮氨酸和甘氨酸，不含半胱氨酸殘基，可誘導非寄主植物的超敏細胞死亡。
它們與任何其他蛋白質缺乏同源性，使harpin成為理想的信使。harpin參與激活基礎防禦通路，可用于局部應用誘導HR。
Harpin作為殼聚糖納米粒子由于其微小的尺寸和電荷将到達假定的受體，當将Harpins作為殼聚糖納米顆粒應用于煙葉時，會通過氣孔進入植物。
殼聚糖的膜滲透性有利于納米顆粒從表皮開口進入，并保留在細胞間隙内，之後它可以被細胞膜上的受體利用。
3.結論
CSNPs即使在納克濃度的harpin誘導煙草分子水準上的SAR也是有效的。初步研究證明，h - csnp通過ROI的發生、核凝聚和胼胝質的沉積進入細胞，進一步導緻防禦基因的上調和抗氧化劑的積累。
進一步減小納米顆粒的尺寸可能有機會通過狹窄的胞間連絲傳遞，進而表現出快速和持久的SAR。
以納米顆粒形式對兩種激發子進行葉面噴霧顯示出有希望的結果，應該在現場水準上進行測試。
本研究的結果表明，殼聚糖納米顆粒與納米harpin的結合将是一種較好的生物農藥防治植物病害的選擇。
4.參考文獻
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