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地形控制已廣泛用于促進骨骼肌形成中的細胞融合過程。偏離凹槽邊界的肌管一般具有一緻的手性方向，該問題長期以來一直沒有得到關注。近日，來自香港城市大學的Ting-Hsuan Chen、Miu Ling Lam教授團隊進行了通過協同細胞微形貌和手性向列學形成骨骼肌管的可擴充模式的相關研究。研究成果以“Scalable pattern formation of skeletal myotubes by synergizing microtopographic cues and chiral nematics of cells”為題于2023年03月10日發表在《Biofabrication》上。
本文設計了一種可擴充和受控的方法引導骨骼肌管形成。通過誘導C2C12肌細胞到不同寬度的凹槽圖案上，觀察到從誘導的第一天起，在寬的凹槽上發育的細胞手性取向增強。涉及細胞遷移和細胞核手性旋轉細胞的主動手性運動随後導緻肌管的統一手性取向。這些手性肌管形成具有增強長度、直徑和寬槽收縮性的特性。Latrunculin A（Lat A）處理抑制細胞的手性旋轉和遷移以及肌管的形成，表明細胞手性向心性對肌管形成至關重要。最後，通過安排具有相應補償角度的寬槽/條紋圖案來協同微地形和細胞的手性向心性，形成了複雜和可擴充的肌管圖案，為骨骼肌組織工程提供一個新政策。
圖1 在溝槽圖案RGD-Au-NOA晶片上形成的肌管分析
通過在不同寬度納米或微槽圖案RGD-Au-NOA基質上誘導肌細胞探讨肌管形成。分化8天後，用α-肌動蛋白1染色，在固定區域内檢查分析顯示窄槽上的肌管密度比平面對照組少15%-25%，100μm槽上多10%。在50um和200um溝槽上檢測肌管密度與平面對照相當。此外，所有寬度溝槽圖案的平均肌管長度與平面對照相比顯著增加。這種提高可能是由于凹槽圖案提供了引導細胞排列的地形因素，促進了細胞端對端接觸和融合率。此外肌管的手性取向在寬槽圖案上也非常明顯，肌管的定向角定義為肌管相對于溝槽/晶片邊界的長軸。肌管的方向在平坦基底上是随機分布的，但在所有溝槽圖案上是單軸排列的。肌管更多的是沿着寬度為0.4和2μm水準方向的凹槽排列。然而，在50、100和200微米寬的溝槽上發現了明顯的定向角的負偏差，證明了伴随着肌管的形成，手性定向的改變。
總之，與超細溝槽（0.4和2微米）相比，寬溝槽（100微米）圖案可以誘導肌細胞分化成具有更長長度、更大直徑和更好收縮性的成熟肌管，表明與超細溝槽上的肌管相比，寬溝槽上的肌管生成明顯增強。手性取向也出現在更長更密的肌管的形成過程中，這表明細胞手性在肌形成過程中高度參與。
圖2 分化前和分化開始時的細胞定向
為了更好了解溝槽寬度對肌管形成的影響，本文進一步研究了有溝槽RGD-Au-NOA晶片上細胞的定向、旋轉和遷移。對于細胞方向的測量，結果顯示細胞高度排列在0.4和2微米的溝槽邊緣。相比之下，大多數細胞在細胞播種後七小時在寬槽（50、100和200μm）上是随機定向的。之後，随着細胞的彙合，出現了一個負偏手性的排列。表明在肌管形成成熟之前，手性取向早期就已經出現。為了了解手性取向的發展，追蹤了細胞在GM中第1天和DM中第2天的遷移。首先監測肌細胞在凹槽圖案上的遷移軌迹。在0.4和2μm的溝槽上，細胞迅速感覺到溝槽微地形，并在兩天内沿着溝槽邊緣遷移。在GM的第1天，細胞在50、100和200微米的溝槽上向各個方向遷移。說明低密度地形因素上細胞之間的額外空間，允許細胞向不同方向遷移，表明手性方向的形成是基于細胞的主動向心性，即在接近彙合時從槽邊的細胞傳播到遠處的細胞。為了探索細胞的手性運動，我們進一步研究了在窄溝（2μm）和寬溝（100μm）上遷移的細胞在遷移過程中的細胞核旋轉和遷移轉角。結果顯示細胞核在2微米的凹槽上無偏見地旋轉，而細胞核在100微米的凹槽上兩天都表現出ACW偏向的旋轉。
以上結果表明，在細胞遷移過程中，細胞核會主動旋轉，細胞内的手性可能會引導手性方向的建立和細胞遷移，最終通過細胞的主動向心性導緻整個培養物的統一手性方向。相反，在狹窄的溝槽上，細胞核旋轉的手性受到抑制，導緻0.4和2微米的溝槽上手性取向的消失。由于在分化的後期，在寬溝槽（100微米）上也發現了具有更長的長度、直徑和更好的收縮性的成熟肌管，表明細胞的手性可能是增強肌形成的一個不可缺少的重要元素。
圖3 肌動蛋白抑制劑對血漿處理過條帶調節細胞特異性和肌管分化處理
為了進一步闡明肌動蛋白的本質，利用單細胞旋轉分析法篩選了三種肌動蛋白抑制劑。
細胞分散在纖連蛋白（FN）塗層的圓環島上，周圍有細胞排斥性的Pluronic塗層。在旋轉分析中，隻有具有圓形的單細胞計數。結果顯示肌細胞表現出明顯的ACW旋轉偏差為55.5%，NSC将其增強到62.08%，Simfh 2将其增強到57.01%。然而，對于Lat A的處理，細胞被逆轉為56.4% CW偏向。是以，使用Lat A研究細胞手性對肌管形成的影響。接着探讨了基于Lat A處理的成肌作用。肌細胞培養在一個非粘附性培養皿上，其上有寬度為500μm的等離子體處理的微條。結果顯示對于未經處理的對照組，在誘導前，肌管及其細胞核的排列方向是随機的，但在肌管形成後出現了一個負方向，在DM中補充Lat A後，肌管和細胞核的方向都出現了相反的正向偏向。在DM中通過Lat A的處理，肌管的形成也減少了約10%。通過同時監測第2天的細胞核旋轉和遷移，結果發現，在對照組中，肌細胞保持ACW-旋轉偏向，而在Lat A處理下，表現出CW-旋轉偏向。同時，遷移（包括側向運動）也被Lat A所抑制。是以，Lat A處理抑制了細胞的活性手性線粒體，最終導緻了肌管形成的減少。
圖4 肌管可擴充模式形成
為了将肌管擴充為可擴充斑紋形成，肌管排列成大尺度同心和徑向形狀。選擇100μm寬槽作為基本機關。首先，一個半徑為1厘米的圓分成12個相等的區域。在每個扇形區域，肌管設計成與外切線平行以形成同心環圖案，與每個扇形區域中線平行以形成輻射狀圖案。接着100μm的凹槽排列在每個扇形區，與标記的所需的方向有一定的補償角。分化8天後，通過在水凝膠上排列凹槽實作了肌管的同心環和徑向模式。本文還探索了使用等離子體處理的條紋與所需的肌管形成排列一起納入無細胞部分的可能性。使用100μm寬的等離子體處理過的細胞粘附條帶與50μm寬的非處理條帶相隔，加以适當的補償角度。在此基礎上，在100微米等離子體處理的條紋（細胞粘附）與50微米非處理的空間（細胞排斥）陣列上，可以形成一個 "CITYU "模式的肌管，證明适當的補償角度是引導肌管形成可擴充模式的成功工程政策。
總之，本文使用微槽的微地形因素指導肌管的形成，在寬槽（50和100微米）上手性取向增強，同時與那些在窄行槽（0.4-2微米）上的手性取向相比，長度、直徑和收縮性都有所增強。對溝槽圖案上的細胞定向、遷移和細胞核旋轉的研究表明，細胞的主動手性向心性是促進肌管分化的關鍵。由于肌管的手性排列是不可避免的，也是主動手性的自然結果，本研究開發了一種政策，利用補償角來協同微地形因素和細胞的手性，引導肌管圖案形成。為設計複雜的、可擴充的圖案奠定基礎，本文結果将對組織重建研究中模式設計産生重大影響。
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