Velvet基因組拼接軟體的使用方法和參數簡介（一）
Velvet簡單介紹：
velvet是一款常用的基因組拼接軟體，與soapdenovo一起常用于二代測序資料的處理，相對于soapdenovo拼接的完整性更好。他能同時支援fasta、fastq格式的資料，同時支援多個文庫的資料同時使用。
其工作的一般過程簡化為：輸入short read序列，排除錯誤，産生高品質的contigs。然後用paired-end read和long read資訊，檢索contigs之間的重複區域。
Velvet工作原理：
1、Bruijn算法
給定的資料總是存在着備援資訊，是以，算法的使用很重要。目前大多數是用的overlap-consensus-layout算法，它的每一個 read都是單獨的實體。而Bruijn算法，将分析基于observed words（或者k-mers）。給定k-mers，不管發現多少次，都是唯一的node。此外，他可以無差别的容納long和short read的混合物。
建構Bruijn圖關鍵在于對所有的reads進行hash。Hash值通過設定參數給定，或者是預設的21。這對所有的序列進行成對比對時會減少 時間，一旦所有的reads已經被hash，由k-mer node可以追溯他們的每一個路徑。增值覆寫率和建立arcs就屬于這種方法。
2、錯誤移除
錯誤移除算法：Tour Bus，對沒有錯誤連接配接的graph進行移除。這要確定基因組中低覆寫率的唯一的點沒有被破壞。是以，這一步在畫圖之後進行。
錯誤的類型主要有：
- Tips：起源于低品質的read的結尾部分沒有任何的重疊。
- Bubbles：他産生于長read的中間或兩個錯誤的read結尾部分重疊。
首先去除tips，由長度和覆寫率來定義。然後去除bubbles，運用的是與Dijkstra’s類似的算法，最後低覆寫率的點會被去掉。
使用方法
在前面的文章中已經介紹了velvet的安裝方法（）。
1.準備輸入資料
無論是fasta格式的資料還是fastq格式資料，首先利用velvet自帶的兩個腳本程式對每一個pair-end資料進行合并；方法如下：
對于fasta格式資料
shuffleSequences_fasta.pl s1_1.fasta s1_2.fasta s1.fasta
最後的得到的資料格式如下（成對的正反向reads連續放在一起）：
>2:1:3789:2197:Y/1
CAGACTAATACCAATCCAACCCATTTCATGAATAAAATGTGACCAATTAACCAACCAACAAAACTGCTTGTTACAAATAA
>2:1:3789:2197:Y/2
ATACAATAACTGTACTAGCTCTACCGTATCTTTTGTTTCATTTCTTCTGGAATAATCACAAAAACTTTTTTGATTATGGA
>2:1:4209:2183:Y/1
TTATAGAAAAGAAAGAAAAGAATGAAAAATAAAGTAATTTTTGATTGGGCCGGGAATCCTATTTTGGATTCGGTATGGAT
>2:1:4209:2183:Y/2
ATCTTTCGCCTATAAATTCAATGAATGAATTACCTCTCAATGATCTTGAATCGGATCAAGATCATGAATAACAATATCTG
>2:1:6191:2192:Y/1
AAAGCATTCACTCCTCTTTTATATCTTGCATCTCTAGTATTTTTGCCCTGGTGGATTTCTCTTTCATTTAATAAAAGTCT
>2:1:6191:2192:Y/2
ATTCCTATACGAAGGTTTTGTAGATGTGTCTCCGAGTATTCCTTGATCATTTCCTCCAAGGGAAGGATTTCCTCTAATTC
對于fastq格式資料
shuffleSequences_fastq.pl s1_1.fq s1_2.fq s1.fq
得到的資料格式與上面類似，隻是資料是fastq格式而已，以上得到的s1.fasta或s1.fq可以直接被後續使用。
2.格式化reads
Velveth用一些序列檔案産生一個hashtable，并輸出兩個檔案：Sequences和Roadmaps。一般使用以下指令即可，藍色标記的部分可以重複，即當你有多個文庫的時候都按照藍色部分的格式來寫
./velveth directory hash_length { [-file_format] [-read_type] [filename] } [options]
directory：輸出檔案所在路徑的名字（即建立一個檔案夾存放結果檔案）
hash_length：也叫k-mer length，預設為31bp，儲存hash length，值越大，記憶體需求越大
filename：标準輸入檔案名
Options:
-strand_specific：轉錄組序列資料，預設為off
支援的檔案格式：fasta，fastq，fasta.gz，fastq.gz，eland，gerald。預設為fasta
讀類别：short，shortPaired，short2，shortPaired2，long，longPaired。預設為short
例子1：
> ./velveth output_directory/ 21 –fasta –short solexa1.fa solexa2.fa solexa3.fa –long capillary.fa ；
預設參數為fasta、short，是以可以寫成：
>./velveth output_directory/ 21 solexa*.fa –long capillary.fa
例子2：
假如你用一個标準的轉錄組序列來做，為使結果更好，可用一下選項（-strand_specific）。
> ./velveth output_directory/ 21 (...data files...) -strand_specific
3.序列組裝
Velvetg是velvet的核心，他建立bruijn圖并對reads進行組裝。
./velvetg directory [options]
directory：工作路徑名
Standard options：
-cov_cutoff <floating-point|auto>：移除低覆寫率的node，預設不移除
-ins_length <integer>：two paired end reads之間的期望距離，預設no read pairing
-read_trkg <yes|no>：在集合中對short read位置進行跟蹤，預設不跟蹤
-min_contig_lgth <int>：導出到contig.fa檔案中的最小contig長度，預設為hash長度的2倍
-amos_file <yes|no>：導出到AMOS檔案中，預設不導出（no）
-exp_cov <floating point|auto>：唯一區域的期望覆寫率
Advanced options:
-ins_length2 <int>：兩個paired-end reads在第二個short-read資料集中的期望距離，預設否
-ins_length_long <integer>：兩個long paired-end reads的期望距離，預設否
-ins_length*_sd <int>：資料集的标準差，預設corresponding length的10%（*代表：nothing，2，_long）
-scaffolding <yes|no>：scaffolding of contigs used paired end information (default: on)
-max_branch_length <integer>：在bubble中的堿基對的最大長度，預設100
-max_pergence <floating-point>：在一個bubble中的兩個分支的最大分歧率，預設0.2
-max_gap_count <integer>：在一個bubble中的兩個分支比對中允許的最大gap值，預設3
-min_pair_count <integer>：構成兩個長contigs的paired end的最小值，預設10
-max_coverage <floating point>：在tour bus後移除高覆寫率的node
-long_mult_cutoff <int>：合并contig的long reads的最小值，預設2
-unused_reads <yes|no>：将不用的reads導出到UnusedReads.fa檔案中，預設否
-alignments <yes|no>：導出一個主要的contig并和參照序列對其，預設否
例子3、
設定覆寫截斷值：
> ./velvetg output_directory/ -cov_cutoff 5.2
排除最高的覆寫資料，設定最大覆寫截斷值：
> ./velvetg output_directory/ -max_coverage 300 (... other parameters ...)
自動設定覆寫截斷值：
> ./velvetg output_directory/ -cov_cutoff auto
例子4、
如果你有一個足夠覆寫面的短read，有任意數量的長read，你可以用長read做repeat。為了達到他，velvet需要對短read的序列有一個期望覆寫的适當的估計。簡單的方法是重疊群被發現的分布，也要看覆寫點的聚類情況。如果期望覆寫是19x：
> ./velvetg output_directory/ -exp_cov 19 (... other parameters ...)
假如你有理由相信合理的統一的覆寫你的sample，你可以要求velvet估計他：
> ./velvetg output_directory/ -exp_cov auto (... other parameters ...)
例子5：
Minimum long read connection cuto?：對于用long reads拼接完成contigs，需要設定一個門檻值來減少誤差（預設為2）。假如你的長序列沒有與之重疊的序列（例如contigs），你可以設為0， 對他直接進行使用。相反的，如果你的長序列覆寫範圍很高，就需要設一個高的門檻值。
Minimum read-pair validation：假如你的資料不是paired-end reads，隻是偶然成對，那麼為減少誤差，就需要你在對兩個contigs進行拼接時至少要有10對pairs（預設）。
> ./velvetg output_directory/ -min_pair_count 20 (...other parameters...)
