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骨骼肌是一個由多核肌纖維組成，負責發力，并由多種類型細胞支援的複雜組織。許多嚴重和緻命的疾病會影響到骨骼肌，是以，建構這種複雜細胞組成和功能的生物工程模型物對于研究肌肉病理生理和開發治療方法很有幫助。近日，來自英國倫敦大學學院的Francesco Saverio Tedesco教授團隊進行了三維水凝膠聯合人類誘導多能幹細胞建構生物工程骨骼肌用于組織、疾病和治療模組化的的相關研究。研究成果以“3D human induced pluripotent stem cell–derived bioengineered skeletal muscles for tissue, disease and therapy modeling”為題于2023年02月15日發表在《Nature protocols》上。
1. 生物工程骨骼肌構造思路及流程
圖1 生物材料和細胞的試點測試和品質控制
本節簡要介紹生成單系或多系三維肌肉所需細胞類型的步驟。首先确認支架和生物材料支援形成排列整齊多核骨骼肌纖維的能力，如使用原代或永生成年人類肌細胞，比hiPSC衍生的成肌細胞更容易獲得。接下來，在分化成特定的衍生物之前對hiPSC起始群體類型、基因組穩定性、多能性和確定無支原體污染進行品質控制。含有血清的培養基（如FBS）可能會産生不同的結果，是以需要從能産生最佳結果的批次中進行批量測試和儲備。
圖2 使用hiPSC衍生原代細胞生成和分析三維骨骼肌構造的工作流程
總流程包括三個主要階段如下。第一步是原代細胞單層擴增，用于制造工程肌肉（步驟1）。本文使用多達四個不同的細胞系（包括兩個系祖細胞衍生的兩種不同方法選擇）：肌纖維，運動神經元，内皮細胞和周細胞。第二步是生成和培養三維人工肌肉構造（步驟2）。選擇哪種祖細胞進行擴增是基于所需的建構體類型（如有或沒有血管細胞或神經支配）。第三步是在下遊應用中使用工程化的肌肉。一些替代的或新的方法來衍生成肌細胞和非成肌細胞系，也可以适用于我們的方法并生成生物工程骨骼肌組織。
2. 生物工程骨骼肌表征及應用
圖3 衍生出的3D生物工程肌肉特征分析
圖4 利用hiPSC衍生三維肌肉對核包膜異常引起的肌肉萎縮症進行模組化
圖5 體外和體内應用hiPSC衍生的3D人工肌肉的例子：測試基因治療載體，評估細胞遷移能力和研究所學生物相容性
三維人工肌肉平台可用于模拟正常或患者人類骨骼肌的特性，如肌纖維形成、排列和生長，與支援細胞類型互動，以及肌肉幹細胞庫的建立。通過這個平台，本文開創了基于hiPSC的肌肉萎縮症3D模型，揭示了由核包膜蛋白缺陷引起嚴重肌肉疾病的關鍵細胞表型特征。三維肌肉在用于模拟骨骼肌層狀病變時優于傳統的二維細胞單層，三維狀态下更好再現了與核包膜基因LMNA潛在突變有關的異常形狀細胞核。利用該政策，本文在三個次元上定義了核主軸長度，作為篩選項目的客觀表型讀數。核畸形特征與臨床表現嚴重程度呈突變特異性相關，最常見和最嚴重的LMNA R249W突變的核變形和拉長程度最大。
研究人員接着測量了關鍵下遊骨骼肌功能，如收縮力和鈣動力學。這些資料可用于開發治療管道，基于小分子或先進的産品，如基因治療載體等。3D建構體的多線性質可以在體外人源化同源平台上測試藥物和先進療法（包括病毒載體和細胞療法）的細胞特異性、毒性和療效。為個性化醫療開辟疾病模組化之外的新途徑，包括藥物和療法測試、毒性研究和體内植入組織替代。hiPSC衍生的三維肌肉可以用來監測活體組織中的表達，并實時監測。（1）用于DMD臨床前基因和細胞治療研究的非整合、非病毒載體和（2）用于神經肌肉基因治療臨床試驗的腺相關病毒載體（AAV）血清類型（AAV9），強調不同轉基因劑量的劑量反應相關性，并為進一步的工作奠定了基礎，即調查不同AAV血清型的細胞和血統特異性，用于精準醫療。使用該三維平台評估病毒載體以外的先進療法的原理證明，并表明可用于評估同源三維肌肉内的肌源細胞移植和遷移，為評估準體内環境中肌源細胞移植提供了一個獨特的政策。
三維類器官平台大大完善、減少和取代了臨床前研究中動物使用。三維人工肌肉、患者特異性、多細胞和同源性減少體内工作所需的動物數量，驗證有限數量的疾病發病機制或治療/毒性測試實驗。進行生物相容性研究顯示生物相容性強，并且hiPSC衍生的三維肌肉（包括單系和多系）在免疫缺陷小鼠中受到急性體積性肌肉損傷或損失，血管化并與宿主組織整合，為使用這種方法組織替代戰略以及從體外工作中選擇療法的體内測試提供了基礎。
該平台将通過以下方式創新和加速科學技術的發展：(1) 研究人類肌體生成，以了解衍生的骨骼肌細胞所不能捕捉到的早期疾病表型；(2) 包括來自研究較少但關鍵的細胞龛進一步分析細胞成分，以及如纖維-脂肪生成祖細胞和肌腱連接配接超級細胞類型；(3) 掌握新興微加工和微流體技術，為精準醫療生成先進片上肌肉模型。
總之，本文使用人類誘導性多能幹細胞進行多系骨骼肌子產品化三維生物工程，細胞首先分化為成肌細胞、神經和血管祖細胞，然後在三維水凝膠張力下結合，産生一個包含血管網絡和運動神經元排列有序的肌纖維支架。三維生物工程肌肉再現人類骨骼肌形态和功能特征，包括表達肌肉幹細胞标記細胞庫建立。生物工程肌肉提供一個高保真平台來研究肌肉病理，例如由突變拉明蛋白引起肌肉萎縮症中出現的畸形核。該方法對于有細胞培養經驗的操作者來說容易操作，僅需9到30天即可建構，具體時間取決于建構體中細胞系數量。本文還提供該先進平台在體外測試基因和細胞療法以及體内研究的應用執行個體，為其作為開發下一代神經肌肉或肌肉骨骼療法工具的潛力做出原理證明。
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