青春才幾年？疫情就占了3年，全世界的科學家們都在竭盡所能的力圖消滅新冠這個看不見的惡魔，但截至目前為止關于新冠病毒仍有許多的未知。
近年來國際上興起的超高分辨率顯微技術，則給科學家們提供了最新的成像手段用來擷取病毒的更多細節，增加對病毒的了解，以幫助人們找到抑制或消滅病毒的方法。
本文借此分享一下STORM超高分辨顯微技術在HIV-1 病毒、流感病毒和新冠病毒研究中所取得的一些進展。
01研究背景
單分子定位顯微鏡介紹
單分子定位顯微成像技術 (SMLM) 是一類在特定實體或化學實驗條件下，利用熒光染料随機閃爍（光開關）特性進行顯微成像的技術。嚴格控制處于“開啟”狀态的熒光基團的數量，使得在任一時間點隻有分布稀疏且超過衍射極限尺度的部分熒光基團可以發光。是以，可以通過寬場成像記錄這些單個熒光基團的空間分布（圖 1）。随機光學重構顯微鏡 (STORM)的作為SMLM技術的典型代表，其采用光可切換探針标記到單個目标分子，通過拟合高斯光斑輪廓對單個分子發光的中心點進行精确定位，進而實作超高分辨率，以 20 nm 的定位精度重建圖像。
圖1.抗體标記病毒的STORM成像示意圖
病毒顆粒固定在載玻片上，并用針對特定蛋白質的熒光抗體染色。全内反射熒光 (TIRF) 成像提供了病毒顆粒的衍射限制圖像。通過記錄熒光基團的“閃爍”并在采集的每一幀中獲得它們的精确定位來實作增強的分辨率。所有幀的單個定位用于重建“超分辨率”圖像。
02應用執行個體
STORM在HIV-1病毒體結構研究中的應用
超高分辨率顯微鏡的使用能夠加深對 HIV 生命周期各個階段的了解，包括病毒組裝、釋放、結構和成熟、細胞間運輸和進入細胞。單個 HIV-1 顆粒2D 和 3D STORM成像， 證明了 Env 糖蛋白在成熟病毒體的膜中形成簇，宿主的抗病毒因子絲氨酸整合蛋白 5 (SERINC5) 可以破壞Env簇，可能會中斷病毒的融合。
利用STORM 成像比較了遊離病毒顆粒 HIV-1 基質殼和衣殼核心與剛剛進入宿主細胞的顆粒的尺寸，通過使用基因編碼标簽标記整合酶或輔助 Vpr 蛋白，或使用針對 CA、MA 或 gp120 蛋白的抗體來獲得有關 HIV-1 病毒顆粒尺寸的高分辨率資訊。展示了STORM在研究病毒顆粒在成熟過程中内部結構重排起始和動力學方面具有相當大的潛力。
03STORM在流感病毒結構研究中的應用
使用STORM觀察到：流感病毒顆粒被脂質雙層包圍，其中嵌入了兩種表面糖蛋白，即血凝素(HA) 和神經氨酸酶(NA)。脂質雙層下面是結構基質蛋白(M1)，它形成一個核心，其中包含 8個病毒 RNA片段，每個片段都與多個核蛋白(NP) 和RNA 聚合酶結合，形成核糖核蛋白(RNP) 複合物。除了這些相似之處，流感病毒顆粒在尺寸和形狀上具有高度的多形性，從直徑約 100 nm 的球形病毒顆粒到長度達到數微米的細絲不等。
圖2流感病毒結構
A&B) 球形和絲狀流感病毒的示意圖。HA–血凝素，NA–神經氨酸酶，M1–基質蛋白1，M2–基質蛋白 2（離子通道）， RNP–核糖核蛋白。C) 用 A/Udorn/72 病毒感染并染色 NA 的 MDCK 細胞的 STORM 圖像，顯示從細胞中出現的長病毒絲。比例尺 10 μm。D) 純化的A/Udorn/72細絲和球體的 STORM 圖像，HA染色。比例尺 2 μm。E) 單個 A/Udorn/72 球形病毒粒子的 STORM 圖像，NA 染色為綠色，HA 染色為紫色。比例尺100 nm。STORM 圖檔來源：牛津大學的 Andrew McMahon
04STORM在SARS-CoV-2(Covid-19的病原體）研究中的應用
超高分辨率顯微鏡也是新型人類冠狀病毒研究的重要工具。用STORM可以看到，SARS-CoV-2 形成直徑從 50 到 200 nm 的球形病毒顆粒，其中包含四種結構蛋白，即刺突 (S)、包膜 (E)、膜 (M) 和核衣殼(N)（圖 3 A和B）。S是一種約 180 kDa 的糖蛋白，作為同源三聚體從病毒表面突出（圖 3 C）并介導病毒與細胞膜受體的結合ACE2。感染 SARS-CoV-2 後，病毒會觸發複制細胞器 (RO) 的生物發生，例如受感染細胞中的雙膜囊泡 (DMV)，進而保護病毒 RNA在複制過程中不被降解。病毒病毒粒子的組裝發生在内質網(ER) 到高爾基中間區室 (ERGIC)，然後通過 Arl8b 依賴性溶酶體胞吐作用進入溶酶體并進入細胞外環境。通過STORM 成像關注到受感染細胞的基底膜平面來研究單個病毒粒子在其進入和離開過程中的大小，并證明網格蛋白的作用囊泡，而不是caveolin-1，作為病毒從細胞表面到早期内體的主要載體。ExM 和光片顯微鏡的組合用于研究四種結構 SARS-CoV-2 蛋白的表達動力學和空間排列，證明 N 蛋白與 RO 的關聯并允許可視化病毒誘導的宿主形态變化細胞結構。
圖3. SARS-CoV-2病毒結構
A) SARS-CoV-2 病毒粒子的示意圖。B) 固定 SARS-CoV-2 顆粒的 STORM 圖像，核衣殼染色為綠色，尖刺染色為紫色。比例尺 5 μm。C) 單個病毒粒子的 STORM 圖像，核衣殼染色為綠色，尖刺染色為紫色。比例尺 100 nm。STORM 圖檔來源：牛津大學的 Andrew McMahon
STORM彌補了電子顯微鏡對于病毒空間資訊的不足，使病毒的結構能夠以納米尺度的分辨率實作可視化，為我們提供了對病毒結構、形态和生物學的認識。當今社會新冠病毒肆虐，SARS-CoV-2 病毒構成的直接威脅，這使STORM為解決 SARS-CoV-2 蛋白與宿主細胞蛋白 SARS-CoV-2 互相作用的問題，細胞内的複制動态，以及 SARS-CoV-2 在感染細胞内複制的确切位點提供了有用的工具。
此外，STORM同樣可用于了解其他現有或新出現病毒、病原體的，結構是怎樣的、如何組裝以及如何與宿主細胞互相作用的研究，并指導制定抗病毒抑制劑和疫苗的政策。