近年來，單細胞測序（scRNA-seq）的興起引領生命科學研究進入單細胞時代，而空間轉錄組（Spatially resolved transcriptomics）技術在保留白間資訊的同時也徹底變革了人們了解複雜組織的方式。是以，空間轉錄組技術也被Nature Methods和Nature雜志分别評為2020年度技術以及2022年最值得關注的七大技術。然而，目前的單細胞測序和空間轉錄組技術并沒有實作完美的融合。一方面，單細胞測序需要在細胞混懸液的基礎上進行單細胞标記，這會導緻細胞空間資訊的丢失。另一方面，目前兩種主流的空間轉錄組技術，1）基于空間條形碼标記（Spatial barcoding-based）的測序技術，如Slide-seq, DBiT-seq, ST, HDST, 10X Visium等，往往以微米級的規則Spot為機關進行測序，尚無法實作單細胞分辨率；2）基于成像技術（Imaging-based）的原位雜交或測序方法，如MERFISH, SeqFISH, STARmap等，能夠在組織中識别出細胞輪廓，進而将亞細胞分辨率的mRNA探針信号聚合成單細胞表達譜，然而，這些靶向方法（Targeted methods）都依賴于探針與靶标RNA的互補配對，是以，無法實作全轉錄組的覆寫以及變異序列的檢測【1】（圖1）。不僅如此，目前的空間轉錄組測序成本昂貴，組織覆寫範圍有限，樣本通量較低，嚴重制約了其推廣與應用。與此同時，傳統的混樣（Bulk）測序一直是生物醫藥研究的主流工具，許多大型Bulk RNA-seq項目如TCGA、ENCODE、ICGC等的相繼開展為生命科學和醫藥學研究累積了海量資料資源。是以，如何充分利用這些遺留資源，從Bulk資料中分析得到單細胞分辨的空間異質性，是該領域所面臨的重大科學問題和技術挑戰。
圖1 不同空間轉錄組測序技術之間的比較（基因檢測數量/細胞或Spot檢測通量）
近日，浙江大學科研團隊在Nature Communications上發表了題為De novo analysis of bulk RNA-seq data at spatially resolved single-cell resolution的研究論文。該研究創新提出了一種空間解卷積算法——Bulk2Space，利用β-VAE等深度學習架構，首次實作将Bulk轉錄組重構至單細胞空間分辨率。
該研究通過引入變分自編碼器（β-VAE）、深度森林（deep forest）等算法，首先對Bulk轉錄組進行解卷積，将其轉化為單細胞轉錄組圖譜，進而将生成的單細胞映射至組織空間中（圖2）。針對目前主流的兩種空間參考圖譜：（1）基于Spatial barcoding的測序方法，如Slide-seq、10X Visium、ST等：Bulk2Space可對每個spot進行解卷積，使其達到單細胞的空間分辨率；（2）基于分子成像的靶向技術，如MERFISH、SeqFISH、STARmap等：Bulk2Space通過空間尋優政策，将細胞映射至最佳的空間位點，使其達到無偏的全轉錄組覆寫度。Bulk2Space也是首個能夠将傳統Bulk轉錄組資料重構至單細胞空間分辨率的算法。
圖2 Bulk2Space算法原理示意圖
研究團隊首先在模拟和真實資料集中對Bulk2Space以及其它算法（RCTD，SpatialDWLS，Stereoscope，SPOTlight等）進行了性能評測，Bulk2Space在兩種情景中都展現出了優異的性能，且成功應用于多種生物學和疾病場景，具有廣泛的應用前景。例如，将Bulk2Space應用于在胰腺導管癌（PDAC）的bulk轉錄組資料的空間解卷積中，研究結果表明，惡性良性腫瘤注釋區域與兩種惡性良性腫瘤克隆細胞的空間分布基本一緻，導管細胞和腺泡細胞的空間分布也與導管上皮和基質注釋區域相吻合（圖3）。同樣地，将Bulk2Space應用于黑色素瘤bulk轉錄組的空間分析中，發現了不同惡性良性腫瘤區域中B淋巴細胞存在很強的空間異質性，表現在基因表達上的巨大差異，對應的生物學通路也完全不同。而這個結果在其它空間解卷積方法中無法實作，正因為Bulk2Space可以将bulk資料重構至單細胞分辨率，才使得細胞異質性和空間差異得以同時解析。随後，利用Bulk2Space分析不同階段前列腺癌bulk轉錄組的單細胞組成和空間分布，發現在前列腺癌由發炎向癌症轉化的過程中（炎癌轉化），細胞種類和基因表達存在着明顯的空間差異。在炎癌轉化過程中，惡性良性腫瘤相關成纖維細胞（Cancer associated fibroblasts， CAFs）在早期的正常腺體中積累，導緻發炎因子高表達，促進局部發炎的發生，進而導緻組織癌變。Bulk2Space的預測結果與這一現象一緻。
圖3 利用Bulk2Space對PDAC的bulk轉錄組資料進行單細胞空間重構分析。（a）單細胞重構結果（b）Bulk2Space預測結果與PDAC病理注釋之間的比較（c）Bulk2Space對腺泡細胞、惡性良性腫瘤克隆A細胞、惡性良性腫瘤克隆B細胞以及導管細胞空間占比分布的預測結果。
論文中，團隊還将Bulk2Space應用于小鼠腦組織不同腦區Bulk資料的空間解卷積分析。相關資料均采自範骁輝教授團隊自主研發的基于雷射捕獲顯微切割技術（LCM）的高通量多樣本空間測序技術——Spatial-seq。如圖4所示，利用Bulk2Space對小鼠皮層bulk轉錄組進行單細胞分辨的空間解卷積，預測結果成功重塑了小鼠皮層的層級空間結構，不同層級中的細胞分布和基因表達均表現出高度的區域化特征（圖4a-b）。同時，利用Bulk2Space對Spatial-seq采集的下丘腦bulk轉錄組資料進行了空間分析，選取MERFISH空間轉錄組資料作為空間參考圖譜，Bulk2Space的預測結果與MERFISH高度吻合。不僅如此，由于MERFISH的靶基因數量（150種mRNA）有限，部分細胞類型難以确定，Bulk2Space成功預測了MERFISH未檢測基因的空間表達分布，進而對這些難以确定身份的細胞進行了二次注釋，彌補了靶向方法的不足（圖4c-f）。
圖4 利用Bulk2Space算法和Spatial-seq技術對小鼠皮層和下丘腦的bulk轉錄組資料進行空間解卷積分析。（a）小鼠皮層單細胞重構結果（b）小鼠皮層各層級細胞類型占比分布規律（c）下丘腦空間重構結果（d）Bulk2Space預測的基因空間表達（e）Bulk2Space對下丘腦中MERFISH未識别細胞的二次注釋（f）Bulk2Space對MERFISH未檢測基因的空間表達預測
Bulk2Spac算法現已開源至GitHub平台（https://github.com/ZJUFanLab/bulk2space）。研究論文由浙江大學藥學院、浙江大學計算機科學與技術學院和軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所聯合報道。
原文連結：
https://www.nature.com/articles/s41467-022-34271-z
制版人：十一
參考文獻
1. Liao J, Lu X, Shao X, Zhu L, Fan X. Uncovering an Organ's Molecular Architecture at Single-Cell Resolution by Spatially Resolved Transcriptomics. Trends Biotechnol. 2021;39(1):43-58. doi: 10.1016/j.tibtech.2020.05.006.
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