外泌體是細胞主動向胞外分泌的納米級雙層膜結構囊泡，攜帶大量生物活性物質，可作為載體在細胞間發揮物質傳遞和資訊交流的作用。近年來，外泌體因其生物相容性好、免疫源性低、可穿越血腦屏障等優勢成為藥物遞送載體的“後起新秀”。外泌體技術作為遞送平台的臨床前和臨床開發均需要大量的外泌體，其分離方法需要易于放大且符合GMP要求以支援大規模生産（圖1）。然而，如上一篇所述（），現在高效的外泌體分離純化工藝的建立是外泌體産業化過程中面臨的關鍵瓶頸問題之一。
圖1 外泌體生産到臨床應用示意圖[1]
外泌體的分離純化
對于治療性外泌體，終産物的純度對于臨床應用與監管至關重要。以外泌體為基礎的藥物成分的生産中需要去除的雜質主要是細胞碎片、蛋白質、宿主細胞DNA以及非外泌體的細胞外囊泡，比如凋亡小體和微囊泡。而外泌體的大小和理化性質與脂蛋白、蛋白質複合體和乳糜微粒等均有不同程度的重疊（如圖2），這也為外泌體的分離與富集帶來了挑戰。
目前實驗室規模已有一些常用的外泌體純化方法，包括超速離心法、免疫分離法、聚合沉澱法、切向流過濾法、分子排阻層析法和微流體分離法等，但業内對于大規模生産外泌體的分離純化工藝還沒有達成共識。這主要是因為并非所有方法都适用于大規模樣品的分離，而且不同方法也各有優缺點，其分離純度與回收率都不盡相同（如圖2）[2]。例如，最廣泛使用的超速離心法可以依據樣品大小與密度進行純化，但難以處理大批量樣本；免疫親和捕獲擷取的外泌體純度較高，但隻能特異性富集表達某幾種特異性表面蛋白質的外泌體；微流體法操作簡單，處理速度快，但依舊隻适合少量樣本的提取[3]。最近的研究表明，切向流過濾和分子排阻層析法（單獨或聯合）可以在大規模外泌體純化中發揮作用[2]，接下來我們結合現有的研究資料為大家詳細介紹這兩種分離方法。
圖2 外泌體不同分離方法的産率與純度[2]
切向流過濾（TFF）
切向流過濾（tangential flow filtration, TFF）是指液體流動方向與過濾方向垂直的過濾形式，是一種壓力驅動的，根據分子大小的膜分離工藝[3]。目前人們利用這一技術對細胞培養上清進行濃縮，富集外泌體的同時去除大部分蛋白雜質，在此過程中也實作換液的目的。此外，中空纖維超濾是一個相對溫和的過程，在濃縮換液的同時，保持了外泌體結構和功能的完整性[4]。
圖3 TFF方法大規模分離外泌體[5]
Gabriella等人建立了一種大規模制備心髒祖細胞外泌體（Exo-CPC）作為藥物産品的GMP級别生産方法，他們在細胞培養後收集了多達8 L的含外泌體的培養基，并通過切向流過濾分離得到Exo-CPC[5]。具體操作時，他們首先使用囊式濾器（ULTA Pure HC 0.6/0.2 mm Capsule Filter，Cytiva）對上清液進行澄清過濾，然後在ÄKTA Flux 6系統中使用300 kDa中空纖維濾柱（Cytiva），将樣品濃縮至300-500 ml，另外加入5倍體積緩沖液進行洗濾換液，回收得到200-300 ml樣品。最後無菌過濾後進行灌裝，得到GMP級别的外泌體産品。如圖3，檢測後發現這一生産方法可達到89%的回收率，雜蛋白去除率高達97-98%。這表明切向流過濾工藝可以應用于大規模GMP級别外泌體産品生産。當然，也有相關研究表明，為了得到更高純度的外泌體樣本，切向流過濾技術也常與其他技術正交使用，如超速離心技術、分子排阻層析以及離子交換層析等。
層析
分子排阻層析利用外泌體和樣品中其它成分在分子大小上的差異進行分離，這一方法可以保持樣品的完整性和生物活性，而且可以很好地進行放大，有能力對大量樣品進行處理。有很多研究都使用這一技術成功對外泌體進行了分離純化，然而，這一方法也有其劣勢，流速較慢、上樣量受到體積限制、樣品純度有待進一步提高等。
基于這一現狀，多模式層析填料Cytiva Capto core 700成為外泌體領域備受喜愛的新寵。Capto core 700由配基活化核心和5 μm惰性外殼組成，惰性外殼不允許超過700kDa的大分子進入核内，而外泌體樣品中的小分子，比如宿主細胞蛋白、DNA片段等，進入核内後，與兼具陰離子交換和疏水作用的辛胺基團結合，進而達到分離目的（圖4）。這一多模式填料通過流穿模式分離外泌體樣品，上樣量更高，而且新一代的Capto基架滿足高流速的要求，高效捕獲污染物的同時節省操作時間。
圖4 Capto Core填料純化外泌體技術原理[6]
Ryan等人在進行大規模外泌體純化的研究時，利用切向流過濾結合PEG沉澱技術以及Capto core 700層析完成了細胞培養上清和血漿不同樣品中外泌體的分離[7]。在完成前處理後，利用ÄKTA Flux S系統，使用750kDa中空纖維濾柱（UFP-750-E-4X2MA，Cytiva）對樣品進行約10倍的超濾濃縮，去除小分子雜質的同時進行換液。随後的RNaseA處理、PEG沉澱和一步Capto core 700層析提高了外泌體純度以及同質性。他們的實驗資料表明，這一方法與單純的超速離心和PEG沉澱相比，得到了更高濃度的外泌體産品，且大小分布更均勻，具有相應生物活性。
當然，不同外泌體應用對于其分離純化要求也不同，除了前面提到的切向流過濾技術與分子排阻層析技術外，也可以結合其他分離方法。例如有研究采用Capto core 700和Capto Heparin兩步層析完成外泌體的分離[8]。
如前所述，外泌體生産工藝流程包括上遊細胞培養、收獲澄清、濃縮換液、分離純化以及除菌灌裝等步驟。正如圖5，依賴于自身豐富的産品線，Cytiva可以提供全流程裝置與耗材，例如上遊細胞培養所需的生物反應器、HyClone培養基、3D微載體，以及下遊的超濾裝置、層析裝置、中空纖維膜以及多種層析填料。在工藝開發中，為了滿足不同外泌體純化需求，除了優先選擇的Capto core 700多模式填料外，也可嘗試Sepharose 4FF/6FF、Capto Heparin以及離子交換等層析填料。
圖5 外泌體工藝流程示意圖
參考文獻（上下滑動檢視）：
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- 王前,鄭磊主編. 細胞外囊泡—基礎研究與臨床應用[M]. 北京：科學出版社, 2019
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- McNamara, Ryan P., et al. "Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles." Journal of extracellular vesicles 7.1 (2018): 1541396.
- K. Reiter, P.P. Aguilar, et al. “Separation of virus-like particles and extracellular vesicles by flowthrough and heparin affinity chromatography.” J. Chromatogr. A 1588 (2019) 77–84.
- Capto core 700 mutimodal chromatography datafile