來源丨科學大院（ID：kexuedayuan）
作者丨譚骁天
北京冬奧會的賽程已接近尾聲，在精彩的比賽之外，也有一些不和諧的消息傳來：
作為圍觀群衆，你可能經常在與興奮劑有關的新聞中聽到“血檢”“尿檢”等字眼，但是，興奮劑到底是怎麼被檢測出來的？在本屆冬奧會中，北京冬奧組委會又使用了什麼檢測興奮劑的新手段呢？
興奮劑檢測：色譜+質譜
經過與興奮劑數十年的鬥争，目前國際上對興奮劑分子的檢測、甄别技術已經越發健全了。雖然北京冬奧組委會尚沒有公布本次奧運會檢測興奮劑的具體方法，但我們可以從曆次大型體育賽事的正常檢測方法中知曉興奮劑檢測的原理。
正常來講，體育賽事中興奮劑的檢測大多是先将運動員生物樣本中的各種分子萃取、分離，然後再依次确定這些分子“身份”。雖然從運動員身上取來的樣品一般都是液體樣品，如血液，尿液，汗液等，但在檢測的過程中，實際上是分了氣體、液體兩條賽道的。
尿液是最常用到的檢測标本，而血液樣品主要用于檢測那些一般不容易進入尿液裡的分子，如生長激素、紅細胞生成素等蛋白/糖蛋白類激素，以及外源性紅細胞等可以提高在賽事中表現力的活性生物制品。尿液中一部分較容易揮發的分子（如一部分小分子類固醇類興奮劑）會參加氣體賽道的檢測，而血液以及尿液中剩下的那些分子量比較大且表現較為“老實”的分子則會出現在液體檢測的賽道中。
目前興奮劑分析的大緻流程
（圖檔來源：作者自制）
檢測step 1——色譜分離不同分子
雖然賽道不盡相同，但在氣體與液體賽道中不同分子的檢測過程卻殊途同歸。這兩種檢測方式的第一步都是先将複雜樣品中所含有的各種分子分隔開，讓它們乖乖排隊站好。
液相色譜/氣相色譜技術
（A）典型的液相色譜結構示意圖，其中橫向柱狀者為LC分離柱。（B）氣相色譜結構簡圖，其中狀如線圈者為GC分離柱。（C）一種以晶片式內建于矽片表面的微型GC分離柱。
（圖檔來源：維基百科（A）,參考文獻1（B+C））
通過樣品中不同分子的分子品質、所帶電荷、親疏水性等實體特征的差別，可以将不同的分子以一定的規律分開，這種方法被稱為“色譜”（Chromatography）。這就好比讓這些分子跑一個漫長的馬拉松，然後通過漫長的路程區分出它們“耐力”的差別。
色譜的名字其實是源于百年前用碳酸鈣從樹葉提取物中分離不同植物色素的俄國植物學家米哈伊爾·茨維特（Михаил Семёнович Цвет）。相信這個實驗，不少朋友在初高中生物課上就已經學習并體驗過了（用濾紙從樹葉汁中分離出葉綠素A，葉綠素B，葉黃素和β胡蘿蔔素）。但在今天，運用色譜技術來分離分子的實體特征中倒是很少包括分子顔色等光學特征了。
在現代色譜儀中用來分離分子的原件，叫做分離柱，現在一般被“生化環材實驗狗”們稱為柱子。一般來講就是一根細長管道中填滿了能與分子發生作用的填料。液相色譜(Liquid Chromatography, LC)中使用的柱子看起來較為短粗（長度一般不超過一米），而在氣相色譜(Gas Chromatography, GC)中，由于氣體分子與填料的互相作用較弱，分離不同分子所需的填料距離往往需要5-10米甚至更長。因為這個原因，氣相色譜的分離柱看起來其實更像一團線圈。
一台比較典型的質譜分析儀
（ 圖檔來源：維基百科）
檢測step 2——質譜儀驗明正身
不管是樣品中的液體分子還是氣體分子，它們在通過色譜儀實作不同分子的分離之後，面臨的下一道關卡都是能夠給它們“驗明正身”的質譜儀(MS)。質譜儀可以将色譜分離純化後的分子進行電離，然後分析它們的“特征指紋”——質譜，進而确定這個分子的真實身份。
值得注意的是，目前在興奮劑檢測領域裡有多種不同且常見的質譜技術，它們都有自己的獨門絕技。例如主要用于檢測痕量興奮劑的DFS 高分辨雙聚焦磁質譜和主要用于區分内源性和外源性睾丸酮的DELTA V 同位素質譜等（人工合成的睾丸酮往往具有更高的碳同位素一緻性，而人體自己産生的睾丸酮分子内的碳原子會含有一部分C13或C14）。
說到睾丸酮，其實還有一段很驚險的舊事，就發生在我們非常熟悉的“不懂球的胖子”——劉國梁身上。1999年世乒賽上，劉國梁被查出血清表睾酮（一種睾丸酮變體）偏高，被懷疑是服用了外源性的興奮劑，險些被禁賽。但實際上，他的血清睾丸酮水準異常是他自己的生理情況導緻的（也許天生骨骼清奇？），并非服用興奮劑。當時正是靠同位素質譜這一新技術以及國際乒聯的多次飛行抽檢，才讓劉國梁洗清了冤屈。
雖然目前色譜+質譜(LC-MS/GC-MS)聯用法仍然是興奮劑檢測的黃金标準，但其它一些技術也在這些年逐漸嶄露頭角。如基于微流控免疫分析的汗液中特殊分子（毒品、興奮劑等）快檢技術（可在20-30分子内完成測試），針對一些常見興奮劑（如麻黃堿類）的ELISA免疫分析試劑盒，走電化學、毛細管電泳等技術路線的興奮劑檢測技術等等。
北京冬奧會：
幹血點技術首次正式使用
不光是檢測技術，運動員樣品的運輸儲存技術、樣品提取技術對非法興奮劑的有效檢出也有很大的影響。
正如前文所說，傳統意義上運動員的生物檢材一般包括血液/血清以及尿液。為了防止尿樣/血樣中的興奮劑分子被水解或在酶的影響下失活，樣本的儲存運輸條件相當苛刻，比如，樣本需要在冷藏（4 C）的環境下盡快送檢，而需要長期儲存的樣品則必須被維持在-20 C之下。
2020年，國際興奮劑檢測機ITA還專門設立了一個用以長期儲存樣品的儲存設施，可将運動員身上采集的各類标本儲存十年以上。此外，樣品運輸到實驗室之後，還需要經過比較複雜的萃取流程，在排除掉細胞與蛋白的幹擾後，才能進入色譜/質譜檢測的流程。
在三種不同濾紙上的幹血點。血液滴在試紙上後會在30分鐘左右的時間内逐漸幹燥。但一般為保險起見，風幹時間至少為2小時（圖檔來源：參考文獻2）
在經過東京奧運會的試驗之後，北京冬奧會的興奮劑檢測流程中正式納入了一種新的樣本采集/運輸技術——幹血點（Dry Blood Spot, DBS）技術。其實這個技術說起來非常容易了解。就是将運動員的一滴血液（可為靜脈血/指尖血）滴在濾紙（或硝酸纖維素膜）上，待其自然風幹兩三個小時即可制成。幹血點技術并不是什麼新技術，它曾在人類與艾滋病、乙型/丙型肝炎、瘧疾等傳染病的鬥争中起到了很大的作用，尤其是在欠發達地區病人的樣本采集活動中被廣泛應用。
單純針對興奮劑檢測而言，在幹血點風幹的過程中，不僅樣品中興奮劑小分子的濃度可以得到濃縮，同時血液中所含的細胞也會失水而死。由于沒有了水和酶的幹擾，幹血點樣品便非常穩定，可以在室溫條件下儲存數日乃至數周。也就是說，在未來的奧運會中，甚至可以不用攜帶保溫裝置，僅通過信封這種簡單的封裝方式就能運輸樣品。
與此同時，由于幹血點樣品中幾乎不含水份，是以在使用甲醇等特殊有機溶劑時更有利于一些疏水性有機物的萃取。這些技術優點都有助于提高興奮劑在後續氣相色譜/液相色譜/質譜等測試中的檢出能力。
結語
俗話說，道高一尺魔高一丈，即便是擁有了這麼多反興奮劑的先進技術和裝置，還是有少數運動員會铤而走險服用興奮劑。要想保證競賽完全公平，仍然是一項非常難做到的任務，反興奮劑還需要各方共同努力。
參考文獻
[1]Zhu, Hongbo. Development of Micro Gas Chromatographs and Micro Photoionization Detectors. Diss. 2019.
[2]Denniff, Philip, and Neil Spooner. "Effect of storage conditions on the weight and appearance of dried blood spot samples on various cellulose-based substrates." Bioanalysis 2.11 (2010): 1817-1822.
[3]Tretzel, Laura, et al. "Dried blood spots (DBS) in doping controls: a complementary matrix for improved in-and out-of-competition sports drug testing strategies." Analytical Methods 7.18 (2015): 7596-7605.
[4]Ramesh, Bokka, et al. "LC–HRMS determination of piperine on rat dried blood spots: A pharmacokinetic study." Journal of Pharmaceutical Analysis 6.1 (2016): 18-23.
[5]http://www.xinhuanet.com/politics/2016-02/27/c_128756864.htm
[6] http://wsjkw.hebei.gov.cn/html/zwyw/20220214/386104.html
[7]http://www.thermo.com.cn/Resources/200901/21111518394.pdf
[8]http://www.thermo.com.cn/e-newsletter/13/pdf/2-1.pdf
作者機關：京津冀國家技術創新中心