文章來自~《中國醫藥生物技術》2021年第3期
作者：楊光，王壘，吳守振
作者機關：710021 西安醫學院（楊光）；710003 西安市兒童醫院心内科（王壘），檢驗科（吳守振）
肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一類由多種病因引起肺動脈壓力進行性升高，最終導緻右心衰竭，甚至死亡的惡性心肺疾病。PAH 病因繁雜，臨床早期診斷困難，長期生存率低。目前認為，遺傳及環境因素共同參與 PAH 的肺血管重構過程，其中遺傳是 PAH，尤其是特發性肺動脈高壓（idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH）和遺傳性肺動脈高壓（heritable pulmonary arterial hypertension，HPAH）發生發展的重要因素，有 25% ～ 30% 的 IPAH 患者發病與孟德爾遺傳因素有關[1]。自從骨形成蛋白 II 型受體（bone morphogenetic protein type II receptor, BMPR2）被發現是 PAH 易感基因以來，科研人員相繼發現了衆多 PAH 易感基因。
1 TGF-β 信号通路相關基因
1.1 BMPR2
BMPR2 基因位于染色體 2q31-32[2]，編碼 TGF-β 超家族成員BMPR2 蛋白，目前已發現大約 370 種 PAH 相關的 BMPR2 突變基因型，其中無義突變、錯義突變、移碼突變和基因重排最常見[3]。70% ～ 80% 的 HPAH 和 10% ～ 20% 的 IPAH 與 BMPR2 變異相關。PAH 患者中，BMPR2 突變者與 BMPR2 非突變者相比較，其發病時間平均提前 10 年，肺血管阻力升高約 35%，平均肺動脈壓升高 8 mmHg，心輸出量降低約 15%，急性血管舒張試驗反應性更低（3% vs 16%），且低年齡人群（平均年齡 35.4 歲）發生死亡和肺移植的風險更高[4]。經典信号通路中，在結合 BMP 配體時，BMPR（ActRIIA 和 ActRIIB）招募、複合和磷酸化 BMP-1 型受體，進一步磷酸化下遊的 SMADs，這些蛋白與通用型 SMAD（如 SMAD4）形成複合物，并轉移到細胞核，與 BMP 反應元件 DNA 序列結合；是以，該複合物作為轉錄調節因子，通過結合在細胞增殖、凋亡和遷移中起關鍵作用的 BMP 反應元件，包括 DNA 結合抑制劑 1、2和 3（ID1、ID2、ID3）或細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A和 2B（CDKN1A 和 CDKN2B），調節靶基因表達。除了經典的 SMADs 信号通路外，BMPR2 還激活幾種非典型的 BMP 信号通路，包括 p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、細胞外信号調節激酶（ERK）、磷酸肌醇 3-激酶（PI3K）/Akt 信号、過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（PPARγ）/載脂蛋白 E（ApoE）/高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）、Wnt 通路、小窩蛋白、Rho-GTPases、蛋白激酶 C（PKC）信号和 Notch 信号通路[5]，BMPR2 通過上述多種機制調控細胞增殖、分化與凋亡。
大量研究證明功能失調的 BMPR2 信号是 PAH 的關鍵特征。IPAH 患者肺血管内皮細胞損傷-修複失衡，維持肺血管内皮細胞内環境穩定、DNA 損傷修複及基因穩定性的 BMPR2-BRCA1 軸表達明顯下調，造成 DNA 修複異常和細胞凋亡抵抗，引起内皮細胞嚴重損傷、血管重塑及血流動力學改變等臨床表征[6]；發炎細胞因子 IL-1β、TNF-α 下調 BMPR2 表達，誘導内皮細胞向間質細胞轉化，這些細胞對 BMP9 誘導的成骨分化作用更敏感，最終導緻管壁鈣化[7]；HIV 病毒蛋白通過 miR-126a 負向調節 BMPR2 表達，誘導肺平滑肌細胞增殖[8]；BMPR2 突變心肌細胞的線粒體功能和胰島素代謝異常，心肌細胞胰島素抵抗增強，葡萄糖攝取減弱，脂質攝取增強，導緻 PAH 右心室脂質毒性變化[9]；在對一例 HPAH 合并疑似遺傳性出血性毛細血管擴張症（hereditary hemorrhagic telangiectasia，HHT）患兒基因分析時發現了 BMPR2 新突變[10]，佐證了 BMPR2 變異者的支氣管血管、肺動靜脈及毛細血管網之間更容易形成異常吻合這一結論[11]。所有異常信号最終都歸于内皮細胞和平滑肌細胞功能障礙的共同途徑上，伴随着凋亡和增殖信号的失衡、血管收縮和血管壁結構變化，遠端肺血管的進行性閉塞導緻肺血管阻力和右心室後負荷增加，引起右心室衰竭和死亡[5]。近年來，BMPR2 的靶向治療主要有三種思路：①靶向調節 BMPR2 受體，增加其活性；②通過調節 BMPR2 上遊的信号，增加細胞表面的受體可用性；③通過靶向互相作用的信号通路重建 BMPR2 下遊信号。重組 BMP9 防止内皮細胞凋亡，可改善 PAH 臨床症狀[12]。目前已有一些藥物顯示出良好的藥理學效應，如他克莫司通過對 FKBP12 和鈣調神經磷酸酶的雙重抑制，激活下遊經典及非經典 BMPR2 信号途徑，臨床IIa 期試驗提示其具有良好的安全性及耐受性[13]。利用腺病毒載體向 PAH 小鼠靶向注入 BMPR2 基因，發現其肌肉化血管得到改善，盡管目前尚未進行人體試驗，但仍然顯示出基因幹預的良好前景[14]。PKC 通路信号抑制劑恩紮妥林可有效逆轉 PAH 相關表型[15]，伴侶 4-苯基丁酸（4-PBA）通過增加 BMPR2 穿梭至細胞膜表面的頻率，提高該受體使用率[16]。依那西普、紫杉醇可通過負向調節 TGF-β 抑制性通路，增加 BMPR2 信号轉導[17]。體外試驗顯示 FK506 和恩紮妥林對 BMPR2 信号激活顯示出相加效應，進一步探讨 BMPR2 受體及其下遊信号的潛在疊加效應可能具有治療價值[15]。
BMPR2 外顯率約 20%[18]，提示有其他因素參與其表觀遺傳過程。與男性相比，攜帶有害 BMPR2 突變體的女性更容易患 PAH[19]。越來越多的證據表明 PAH 與内源性雌激素的合成與代謝功能失調、促有絲分裂雌激素代謝産物累積有關。16-羟基雌酮（16OHE1）抑制正常 BMP 通路信号，增加 BMPR2 突變外顯率。有趣的是，雌激素的甲氧基代謝物反而有肺血管保護作用[20]。肥胖也可通過影響雌激素代謝參與 PAH 發病[21]，芳香化酶作為内源性雌激素合成的重要酶，目前，已有小規模臨床試驗表明其抑制劑阿那曲唑能改善男性及絕經婦女的 6 分鐘步行試驗[22]。最新研究發現了一種新的心髒保護性 E2-ERα-BMPR2-apelin 軸，也為 PAH 右心室靶向治療提供了新方向[23]。動物實驗發現，随着年齡增長，實驗小鼠的心輸出量、肺血管阻力及體循環壓均呈現惡化趨勢，PAH 外顯率随之升高[24]。此外，微小核糖核酸（miRNA）常通過抑制相關翻譯過程調節基因表達，尤其是 miR-29、miR-124、miR-140、miR-204作為 PAH 生物标志物及治療靶點的優勢，日益受到重視[25]；基于人工補充 miRNA 類似物或抑制特定 miRNA 表達的治療方法，目前一些基于微小核糖核酸的藥物尚處于臨床試驗中，療效有待觀察[26]。miRNA 臨床測定及其分子本身的不穩定性、轉運方式和非靶效應特點，仍然是該領域研究的巨大挑戰[27-28]。PAH 患者代謝明顯紊亂，肺血管内皮細胞有氧代謝減少，糖酵解增加，谷氨酰胺分解增加，脂肪酸氧化減少，加速一氧化碳代謝等變化引起内皮細胞異常增殖、血管增生及右心重塑等表型，異常高表達的精氨酸酶通過裂解精氨酸，減少内皮依賴性的一氧化氮合酶（eNOs）合成，使血管舒張功能受損，此外，還原和氧化細胞環境、三羧酸循環等代謝途徑也存在異常，這些研究為 PAH 治療提供了衆多新靶點，目前，已有一些針對糖代謝途徑的藥物，如丙酮酸脫氫酶激酶抑制劑二氯乙酸鹽、以糖酵解酶烯醇化酶（ENO）為靶點的 PFKFB3 在降低 PAH模型大鼠糖代謝及改善右心室功能方面已經取得了一些成功[29]。這些研究都提示包括性别、年齡在内的多種因素參與 PAH 發病。在有害的 BMPR2 突變背景下，還可能有多種遺傳因素及環境的“二次打擊”也促使 PAH 發病，需要進一步探索[30]。
1.2 ALK1
遺傳性出血性毛細血管擴張症（HHT）是以皮膚黏膜毛細血管擴張、反複鼻出血、動靜脈畸形（尤以肺部、肝髒和顱腦血管畸形多見）為特征的常染色體顯性遺傳病，HHT 常合并 PAH[31]。HHT 的重要遺傳學病因是編碼激活素受體樣激酶 1（activin receptor-like kinase 1，ALK1）和内皮素（endolin，ENG）受體的基因發生突變。Chen 等[32]研究顯示中國漢族人群的 ALK1 和 ENG 變異率分别為 57.1% 和 14.3%，同時還發現了位于 ENG 第 8 和 14 号外顯子的兩個新突變位點。PAH 的發生與 BMP 通路抑制和TGF-β通路異常活化密切相關，提高 ALK1/ENG 蛋白表達，改善其功能是取得突破性治療的關鍵。細胞和動物實驗已發現多種調節劑，其中包括：①PI3K 抑制劑，可抑制動靜脈畸形形成；②酪氨酸激酶抑制劑TKIS，能改善貧血和胃腸道出血；③整合素激活劑 CXCL12，使内皮素與白細胞、周細胞或血小闆上相應的整合素結合；④BMP9 作用于 ENG 和 ALK1 的上遊，其阻斷可加重 HHT 症狀；⑤氧化甾醇和其他核 LXR 激動劑能夠上調 ENG 的表達；⑥可溶性内皮素、TRC105 和 ACE-041，均具有抗血管生成作用，進一步研究這些靶點，對于 PAH 診治至關重要[33]。
2 非 TGF-β 信号通路相關基因
2.1 KCNK3
KCNK3 編碼TASK-1（K2P3.1），是一種雙孔鉀離子通道，存在于包括人 PASMCs 在内的多種細胞膜上，主要作用是維持細胞膜靜息電位，調節肺血管緊張性[34]。Ma 等[35]通過研究一個原發性 PAH 家系，發現包括c.608G→A（G203D）在内的 6 種 KCNK3 錯義突變，證明該基因為 PAH 緻病候選基因，這些雜合錯義突變均為有害突變，電生理學研究顯示其均可導緻離子通道功能喪失，而磷酸酯酶抑制劑ONO-RS-082 可改善受損通道的部分功能。研究顯示有 1.3% IPAH 和 3.2% HPAH 攜帶這些突變基因，2/9 的 KCNK3 突變攜帶者無臨床表現，提示 KCNK3突變不完全外顯。2016 年，Navas Tejedor 等[36]發現了該基因2 個新錯義突變（p.Gly106Arg 和 p.Leu214Arg），p.Gly106Arg 是發現的首個 KCNK3 純合突變，該突變可能通過修飾位于鉀離子通道跨膜蛋白 106 位的甘氨酸參與 PAH 發病，正常情況下該位點介于膜内區和跨膜區之間，高度保守。2017 年，研究人員發現了日本首例 KNCK3 突變（p.Gly203Asp）[37]。研究發現，KCNK3 敲除，小鼠的肺血管平滑肌細胞膜靜息 K+電流明顯減弱，呈現去極化興奮狀态，肺組織廣泛微血管收縮，右室收縮壓升高；其末端肺血管（直徑 < 30 μm）密度增加，微小血管肌化，膠原廣泛交聯。血管内皮細胞保護因子 CD31 和 VWF 表達失衡，導緻血管内皮損傷[38]。實驗小鼠 PASMCs 内 HIF1-α 表達上調，肺血管低氧易感性增加；ERK1/2 和 Akt 的Thr308 磷酸化信号通路激活；凋亡抑制基因家族成員生存素表達增多；這些途徑均可導緻 PASMCs 異常增殖，形成 PAH 病理基礎。電鏡下觀察 KCNK3 表達缺失的 PAH 模型小鼠的内皮細胞胞膜，其表面的小窩蛋白分布異常，小窩結構變淺，提示 KCNK3 可能通過影響内皮細胞物質轉運及信号轉導，調節内皮細胞功能；同 BMPR2 突變類似，人類 siRNA-KCNK3-hPASMCs 細胞模型發現，線粒體膜發生同細胞膜相似的去極化，且部分線粒體膜裂解，進一步證明了 PAH 發病與亞細胞結構和功能異常相關。最新研究[39]發現，維生素 D 缺乏的 PAH 大鼠心肌細胞表面電壓門控性和酸敏感性鉀離子電流減弱，内皮細胞功能惡化，PASMCs 去極化，動脈肌化，引起肺動脈壓力中度升高，可能與 VDR 靶基因表達失調有關，維生素 D 活性形式骨化三醇可顯著增加 KCNK3 表達，改善臨床症狀，鑒于 VDR 靶基因衆多，且早期預防價值大，應該進一步深入研究 VDR 相關基因及其分子機制。
2.2 TopBP1
TopBP1 與人乳腺癌蛋白 1（breast cancer 1 protein，BRCA1）的 C 末端 BRCT 結構域同源，在蛋白連接配接、DNA 複制啟動、轉錄調節、DNA 損傷修複及細胞周期“檢查點”等方面至關重要[40]。2013 年，de Jesus Perez 等[41]通過全外顯基因測序證明TopBP1 為 IPAH 的易感基因。IPAH 患者血管内皮細胞的 TopBP1 表達減少，使内皮細胞 DNA 損傷及凋亡易感性增加，修複其表達可明顯減少細胞凋亡，改善血管損傷；進一步功能研究發現 p.S817L 為意義不明确突變，p.R309C 為緻病性突變，p.N1042S 為良性突變，提示單純基因突變不可能是 PAH 的唯一緻病因素，存在其他因素影響其臨床表征，需要進一步功能研究闡明影響突變基因蛋白功能的潛在因素[42]。BRCA1 通過 BMPR2-BRCA1 環路調節 BMPR2 表達[6]，提示與其含有同源結構的TopBP1 也可能通過類似或其他機制影響 BMPR2 表達。
2.3 TBX4
目前認為，TBX4（T-Box transcription factor 4）（可能還有附近的其他基因座，包括 TBX2）的突變是一種以異常的可變表達為特征的綜合征，如骨骼發育不良（包括手腳發育異常）、發育遲緩、聽力損失、先天性心髒病缺損（如動脈導管未閉、房間隔缺損、主動脈瓣缺損）和 PAH[43]。研究發現兒童 TBX4 突變率高于成人，法國 TBX4 相關 PAH 研究顯示女性占優勢，年齡分布呈雙峰型，通常在兒童時期或 40 歲以後出現[44]，與 BMPR2 相關的 PAH 一樣，女性占優勢表明性别因素參與了 TBX4 突變體的 PAH 發病機制，值得注意的是，TBX4 突變常出現肺發育缺陷[45]，這也為 PAH 分類帶來新的變化，究竟 TBX4 突變的 PAH 患者屬于肺發育異常因素還是遺傳因素，仍需要進一步探索 TBX4 信号的分子和其他特征，尤其是與肺血管系統和表型變異的研究。
2.4 CBLN2
CBLN2 是目前唯一一個經全基因組關聯研究證明的 PAH 易感基因，該基因突變使 PAH 發病風險增加1.97 倍[46]，相繼有研究[47-48]在慢性血栓栓塞性肺動脈高壓（CTEPH）及系統性紅斑狼瘡性肺動脈高壓（SLE-PAH）患者中發現了 CBLN2 新突變位點，目前，CBLN2 作為 PAH 易感基因，研究甚少，具體機制有待闡明。
2.5 新發現的緻病基因
Gräf 等[49]通過全基因組測序研究 1038 位實驗組 PAH患者及 6385 位對照組非 PAH 受試人員，發現了新的 PAH緻病基因（ATP13A3、AQP1、SOX17、GDF2）。實驗組内，與無基因突變的 PAH 患者的診斷年齡（51.7 + 16.6）歲相比，AQP1 及 SOX17 突變的 PAH 診斷年齡明顯提前[（32.8 width=2.4,height=0.6± width=2.4,height=0.616.2）歲，Pwidth=2.4,height=0.6= width=2.4,height=0.60.002 和（36.9 width=2.4,height=0.6±width=2.4,height=0.6 14.3）歲，Pwidth=2.4,height=0.6=width=2.4,height=0.6 0.013]。功能研究表明，ATP13A3 mRNA 在 PASMCs 中表達，而 ATP13A3 的缺失抑制内皮細胞增殖并增加細胞凋亡，這與 PAH 的病理變化一緻。Gelinas等[50]首次報道了兒童 ATP13A3 突變，目前對于 ATP13A3 在血管細胞中的功能及其分子機制知之甚少，尚需深入研究。GDF2 突變導緻 BMP9 和 BMP10 循環水準降低，這為通過增強 PAH 中 BMP9 或 BMP10 信号治療 PAH 的政策提供了依據[51]。AQP1 編碼細胞膜上的水通道蛋白，參與内皮細胞遷移和血管再生[52]，動物實驗發現 PASMCs 的 AQP1 表達缺失可改善低氧誘導的 PAH 大鼠模型的臨床特征[53]，提示需要進一步研究明确 AQP1 突變對水分子轉運功能的影響及其在 PAH 發病過程中影響的具體細胞類型及相關機制；最新研究[54]發現，醛固酮通過刺激水通道蛋白的表達和肺動脈平滑肌細胞的增殖促進肺動脈高壓的發生，螺内酯可通過調節 AQP1 和 β-連環蛋白抑制平滑肌細胞增殖。一項關于日本 HPAH 和 IPAH 患者的研究證明 SOX17 是 PAH 易感基因[55]。另外一項包含 256 名 PAH 患者的研究[56]發現，0.7% 的 IPAH 和 3.2% 的先天性心髒病相關的 PAH（PAH-CHD）患者發生 SOX17 突變，且大多數 SOX17 的錯義突變發生在高度保守的 HMG 結構域，在發育過程中的心髒及血管組織可發現該突變明顯富集，提示該突變是先天性心髒病和 IPAH 發生的危險因素，進一步研究 SOX17，對于 PAH-CHD 高發的兒童群體意義重大。SOX17通過與多條 PAH 信号通路和轉錄靶點互相作用，參與 PAH 發病，修複 SOX17 表達和信号轉導可能是治療 PAH 的一種新政策[57]。
3 遺傳咨詢
目前已經在 IPAH、HPAH、PAH-CHD 及肺靜脈閉塞病/肺毛細血管病（pulmonary veno-occlusive disease or pulmonary capillary hemangiomatosis，PVOD/PCH）等多種類型 PAH 中發現了突變基因，法國對上述高危人群提供遺傳咨詢及基因檢測，2015 年歐洲心髒病學會（ESC）和歐洲呼吸學會（ERS）釋出《肺動脈高壓診斷和治療指南》建議對患有 PAH 或 PVOD/PCH 病的成人和兒童以及有攜帶易感突變風險的成人親屬進行遺傳咨詢和檢測。臨床醫師應該在技術允許的條件下，向這些高危群體及其家庭成員告知遺傳風險，以便進行篩查和早期診斷。家庭中的基因檢測應該從受影響個體開始，如果家族突變已知，并且未受影響的家族成員該突變檢測為陰性，那麼該成員患 PAH 的風險與普通人群相同，這不僅有助于協助診斷，更能提供充分的心理安慰；即使沒有進行基因檢測，也應該讓患者了解其臨床症狀及體征，以確定診斷的時效性。鑒于外顯率的不完全、生殖問題、基因歧視以及伴随基因病的各種社會心理問題，在基因檢測前，應進行充分的基因教育及咨詢，這些工作需要專業的臨床醫師、基因咨詢師、遺傳學家及檢測機構共同完成[1]。
4 展望
自 20 世紀 50 年代以來，PAH 的遺傳學研究快速發展，這些研究不僅從基因和分子層面揭示了 PAH 發生發展的原因，推動了 PAH 臨床診療；也為靶向藥物治療開辟了道路，極大改善了其臨床預後。但是，該領域目前仍面臨若幹問題亟待解決：①研究難度大：PAH 與多病因、多系統相關，常合并其他疾病，且診斷金标準（右心導管測壓）嚴格，造成其研究常常受入選标準限制，且單中心研究效力欠佳，最好開展多中心研究；②機制尚不清楚：目前發現的衆多易感基因，僅表現出相關性，但其具體的信号通路及分子機制尚不完全清楚，同時新的潛在易感基因有待發現；③表觀遺傳學研究不足：新生突變、基因座異質性以及包括 BMPR2 在内的多個突變基因的不完全外顯現象均提示 PAH 基因型與表型并非一一對應關系，基因修飾與環境因素如何在 PAH 發生發展中發揮作用，仍需深入探索。PAH 遺傳學研究挑戰巨大，但其前景廣闊，進一步深化該領域研究，對于了解 PAH 發生發展、開發新的靶向藥物、提高臨床診治和指導生育等方面具有重要意義。
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基金項目：西安市科技計劃項目重大研究項目（2017123SF/YX017(2)）；西安市局級科研項目（J201601002）
收稿日期：2021-02-20
DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.013