mage J和Graphpad如何對Western Blot條帶灰階分析

WB是研究蛋白表達的一個經典方法。對于一些時間點或者是不同組織蛋白表達量的分析就涉及到量的變化。一些凝膠成像軟體帶有此分析工具，比如Quantity One，Bandscan，Gel-Pro Analyzer等成像系統專用軟體。除了這些軟體，還有一個比較簡單的綜合性質圖像處理軟體Image J可以很友善的進行灰階分析。而且Image J是開源性質的免費軟體，可以在其官網直接下載下傳使用。

對Western Blot條帶進行數值化有兩種方法——灰階分析和光密度分析。灰階是計算機圖像分析儀根據圖像顔色深淺分為256個級别。灰階值越小物體顔色越深。光密度是指光線通過溶液或某一物質前的入射光強度IO與該光線通過溶液或物質後的透射光強度Ib比值的對數OD=log（IO/Ib）；圖像分析中，入射光和透射光強度分别被切片上最亮區域的平均灰階值和待測目标平均灰階值取代，則圖像分析系統的光密度值=log（切片标本最亮區域的平均灰階值（g0）/待測目标的平均灰階值（g））。光密度值越大，物體顔色越深，陽性物質相對含量越大。

對于灰階值來說，切片标本制作時染色時間長短，以及測量時顯微鏡照明光源電壓的大小對其影響很大。而光密度是一個比值。是通過計算一張切片标本最亮區域的平均灰階值與該切片标本中待測目标的平均灰階值的比值，再根據數學公式計算而來的，是以受切片标本染色時間長短及照明光源電壓關系很小。

然而有研究實踐顯示，灰階值與光密度值二者之間存在着線性關系，都可以用來進行WB定量分析。

    同樣，Image J軟體進行WB條帶定量分析時也存在兩種方法，此處隻列舉一種方法，具體步驟如下。 1、下載下傳安裝，并打開Image J軟體。 2、導入WB條帶圖檔。File→Open→ 彈出對話框→選擇檔案夾→找到WB條帶。 3、把圖檔轉化成灰階圖檔：Image→Type→8-bit。這時WB圖檔将會随之改變。

4、消除圖檔背景的影響。Process→Subtract Background。在彈出的對話框中，填上50基本就可以了，也可以稍高些，并勾上Light background，點選OK即可。此時圖檔背景會變白一些。

5、設定定量參數。Analyze→Set Measurements。在彈出的對話框中勾選Area、Mean gray value、Min & max gray value、Integrated density。

6、設定機關。Analyze→Set Scale。在彈出的對話框“Unit of length”後面填上“pixels”，其他的不用改動。

7、把WB圖檔轉換成亮帶。Edit → Invert。 8、選擇菜單欄下的一系列不規則圓圈，根據情況選擇一種。然後将圓圈手動拉倒第一條帶，并盡量将條帶都圈起來。

9、點選菜單欄Analyze下拉出現的measurement，即可彈出你標明區域的灰階統計值。也可以點選快捷鍵（英文狀态下的鍵盤m）。

10、手動移動不規則圓圈至下一條條帶，重複8、9步驟，直至所有條帶都被測量。 11、當測定完所有條帶，選結果中的“Edit”的“Select All”，然後複制資料“IntDen”到Excel表即可進行分析。也可以直接在Results對話框中，選擇File → Save as，直接導出excel表格。

12、在excel表格中将目的蛋白的灰階值除以内參蛋白的灰階值，進行歸一化處理。

13、下載下傳安裝，并打開Graphpad軟體。 14、在對話框左側欄目“New table & graph”下選擇“Column”。然後再右側選擇所要作的圖形，以及是否顯示誤差棒等，具體如下圖。

15、在彈出的表格中，填上excel中的比值。

16、然後點選菜單欄上Insert → New Graph of Existing Data... 。也可以在工具欄Sheet中的“New”條目下找到。（其實這步可以省略）

17、在彈出的對話框“Create New Graph”中，填寫新圖名稱，選擇分析方法，圖形，以及誤差棒的表示方法，具體如下。（其實這步可以省略）

18、此時，可以在工具欄下左側的狀态欄“Graphs”檔案夾中找到所建新圖“Date 1”。

19、此時可以對圖形的外觀進行修改，增加圖檔題目以及XY軸名稱。直接在圖上對應位置左鍵點選修改。

20、也可以借助工具欄“Change”中的功能鍵對圖檔的柱形圖顔色、寬度、高度、間隔等進行調整。

21、然後點選工具欄“Export”将建立的柱形圖導出。

22、上面隻是單因素的柱狀圖建構方法。如果是雙因素，應該在一開始選擇“Column”時選擇“Grouped”。切記！！