前言
高等甲殼類動物是物種最豐富、形态最多樣化的非昆蟲節肢動物類，其許多成員具有重要的商業意義。盡管甲殼類動物的DNA序列資訊呈指數級增長，但對Malacostraca的基因組組織知之甚少。在這裡，我們建構了一個細菌人工染色體（BAC）文庫。
并進行了BAC末端測序，為甲殼類動物中最廣泛養殖的物種之一kuruma shorma蝦提供基因組資訊，并在BAC文庫中發現了備援序列的存在。我們檢查了包含備援序列的BAC克隆，以進一步分析其在kuruma蝦基因組中的長度，拷貝數和位置。
Mj024A04 BAC克隆包括一個備援序列，包含27個假定基因，似乎顯示出正常的基因組DNA結構。值得注意的是，在推定的基因中，3個基因将同源蛋白編碼為細胞凋亡蛋白抑制劑，7個基因将同源蛋白編碼為白斑綜合征病毒，白斑綜合征病毒是一種已知影響甲殼類動物的緻命病原體。
對381個BAC克隆的集落雜交和PCR分析表明，幾乎一半的BAC克隆保留了DNA片段，其序列與代表性的BAC克隆Mj024A04同源。在kuruma蝦核基因組中多次檢測到Mj024A04部分序列，計算出的拷貝數至少為100。基于微衛星的BAC基因分型清楚地表明，Mj024A04同源序列是從至少48個不同的染色體位點克隆而來的。與水蚤和果蠅的可用基因組序列缺乏微共性關系，這表明這些片段在目前節肢動物基因組序列中的kuruma蝦中具有獨特性。
摘要
甲殼類動物的基因組大小差異極大，最小的甲殼類動物的C值為0.14 pg，最大的基因組重64.62 pg，相差460倍。盡管甲殼類動物的經濟重要性和巨大的生物量産量，但人們對甲殼類動物的基因組組織知之甚少，尤其是馬拉科斯特拉卡（包括蝦和蟹），除了存在許多重複序列。
最近，盡管甲殼類動物水蚤水蚤的基因組DNA序列已經确定，但對甲殼類動物基因組做出任何結論似乎都不合适，因為最近基于DNA序列資料和六足動物（包括昆蟲）和甲殼綱之間的形态比較的系統發育分析提供了一個意想不到的發現，即分支足類（包括水蚤水蚤）在系統發育上更接近六足動物而不是Malacostraca 。是以，需要闡明甲殼類動物基因組，特别是分支足類和六足類群與其他姊妹類群之間的遺傳差異。
在馬拉科斯特拉卡被歸類為Decapoda的Penaeid蝦一直是深入研究的主題。由于其商業價值，過去幾年中發表了幾篇關于表達序列标簽（EST）分析和遺傳連鎖圖譜的論文。然而，它們的大基因組的深度資訊在很大程度上是未知的，估計其大小約為人類基因組的70%，并且富含AT和AAT序列。
作為了解蝦基因組組織的第一步，我們從kuruma蝦（Marsupenaeus japonicus）建構了一個BAC文庫（名為MjBL2），并進行了BAC末端測序。結果清楚地表明，在MjBL2文庫的許多BAC克隆中，某些序列存在極端備援。我們選擇一個BAC克隆（Mj024A04）對其整個序列和蝦基因組中的備援進行詳細分析，并發現了許多包含Mj024A04序列的DNA片段拷貝。這表明這種特殊DNA片段的超擴增是通過kuruma蝦基因組進化過程中的節段複制事件發生的。
BAC文庫建構和BAC末端測序
為了概述庫魯瑪蝦核基因組的組成群組織，我們使用由2隻蝦的血細胞制備的庫ruma蝦基因組DNA建構了BAC文庫（MjBL13），并分析了BAC末端序列（BES）。MjBL2由49，152個BAC克隆組成，排列在128個微量滴定闆中并儲存在-80°C。 通過 Not I 消化 135 個随機選擇的 BAC 克隆，平均插入片段大小估計為 205 kb。
使用從MjBL192中随機選擇的2個BAC克隆進一步進行BES分析，并組裝檢索到的讀數以實作連續性[DDBJ：AG993477-AG993734]。所得BES被分為29個單例和51個連續序列，包括2至24個讀段。值得注意的是，BLASTN和BLASTX分析顯示，這些BES中的許多（BLASTN中有20個讀數，BLASTX中有55個讀數）含有編碼類似于黑虎蝦（斑節對蝦）中報告的“細胞凋亡蛋白抑制劑（IAP）”的蛋白質序列。
代表性BAC克隆的DNA序列
從MjBL024中随機選擇具有類似“黑虎蝦IAP”基因的BAC克隆（Mj04A2），采用鳥槍法測序方法對其整個DNA序列進行詳細分析。通過計算機注釋分析所得的120 kb基因組DNA序列（Mj024A04序列），揭示了27個推定基因，這些基因顯然似乎是具有外顯子内含子結構的正常基因組區域[DDBJ：AP010878]。
在序列側翼基因09的中間發現了大的GGTTA重複序列，該基因編碼類似于紅泷河豚逆轉錄酶的蛋白質。值得注意的是，在其他26個基因中，三個基因（基因01、06和24）編碼與三個物種的IAP同源的蛋白質，非洲爪蟾（非洲爪蛙），黑腹果蠅（果蠅）和挪威鼠（挪威大鼠），七個基因（基因11，13，14，15，16，17和18）與“白斑綜合征病毒（WSSV）”中的ORF同源， 主要的蝦緻病性dsDNA病毒，對蝦以及其他甲殼類動物如螃蟹和小龍蝦具有高毒性。
間間蝦基因組中Mj024A04序列及其拷貝數的檢測
接下來，我們采用Southern 印迹雜交，使用幾種不同的限制性内切酶檢測庫魯瑪蝦基因組中 Mj024A04 序列的多個拷貝。結果顯示，4個假定基因（基因01、09、16和27）中的每一個都有多個DNA條帶，證明了這些基因的多個拷貝的存在。此外，我們使用标記的Mj024A04 BAC克隆進行了熒光原位雜交（FISH）。
FISH圖像清楚地顯示了成年蝦睾丸細胞核中的許多熒光斑點。随着大重複序列的重複，我們使用由01個不同器官（腦，血細胞，心髒，睾丸，肌肉，泳腿和腸）和09個幼蟲制備的基因組DNA通過基因16，27，7和3的定量PCR進一步檢查了推定基因的拷貝數。
我們的結果表明，這些推定基因的拷貝數是推定單拷貝基因谷氨酰胺轉氨酶（TGase）的100倍，除了基因09（逆轉錄轉座子）。這表明存在多個Mj024A04序列拷貝。綜上所述，我們的結果表明，大DNA片段Mj024A04在基因組中多次出現。
Mj024A04序列中推定基因的BAC基因分型和PCR檢測
為了排除可能的克隆偏倚，我們使用三種微衛星多态性進行了BAC基因分型。從MjBL299闆342至2篩選的001個F，M，R陽性BAC克隆中檢測到008個不同的基因型，代表蝦基因組的0.2覆寫率。對從不同基因型中選擇的八個獨立的BAC克隆進行的基于PCR的推定基因檢測顯示，幾乎所有17個推定基因都存在。假設所有蝦都有異質染色體，應該檢測來自一個等位基因的兩種基因型。
由于我們從2個個體建構了MjBL13文庫，是以一個染色體位點最多預計有26個不同的單倍型。檢測到的299種不同基因型表明，至少有11個不同的染色體位點包含整個Mj024A04序列的重複。
BAC文庫建構和BAC末端測序，用于首次表征kuruma蝦基因組
據報道，庫魯瑪蝦核DNA的含量為2.83pg，表明庫魯瑪蝦的基因組大小與其他對蝦（如南美白對蝦和斑節對蝦）幾乎相同，據報道其基因組大小約為2，000Mbp。在這項研究中，我們首先從kuruma蝦建構了BAC文庫。MjBL2 BAC克隆的平均插入片段大小估計為135 kb，總MjBL2插入片段大小可計算為約6，600 Mbp，表明MjBL2代表了kuruma蝦基因組覆寫率的3.3倍。
雖然MjBL2不适合實體定位和基因組測序，因為它是由13隻蝦建構的，但MjBL2作為表征kuruma蝦基因組的第一步是有用的。我們進行了BES分析，以首次了解未測序的kuruma蝦基因組的序列組成。BES分析的結果非常令人驚訝，因為即使隻分析了192個克隆，我們也檢測到了51個重疊群，每個重疊群包含多個讀數，從2到24不等。
這表明，按照典型的BAC建構方法，我們在kuruma蝦基因組中獲得了相同DNA片段的多個拷貝。然而，我們用BLAST注釋的黑虎蝦IAP基因同系物等推定基因似乎不像轉座元件那樣具有潛在的重複活性。為了進一步确定庫魯瑪蝦基因組的異常，我們進一步分析了庫魯瑪蝦基因組中的這些DNA片段。
代表性BAC克隆Mj024A04的基因内容
對具有黑虎蝦IAP序列的BAC克隆随機選擇的Mj024A04 BAC克隆進行全測序，并在計算機中預測了27個基因。在預測的27個基因中，我們發現三個基因與IAP同源。衆所周知，細胞凋亡是受控細胞自殺的遺傳程式途徑，在發育、組織穩态、DNA損傷反應和病理過程等多個過程中具有關鍵作用。
IAP已被證明通過直接結合IAP中存在的杆狀病毒IAP重複（BIR）結構域來抑制半胱天冬酶（凋亡機制的核心成分）的蛋白水解活性來阻斷細胞凋亡。稱為含BIR結構域的蛋白質（BIRP）的細胞同系物的特征在于存在可變數量的BIR結構域。這些同系物已在酵母、線蟲、蒼蠅和高等脊椎動物中發現。
在果蠅中，已發現1種IAP同系物（Thread或IAP2、IAP12265、Bruce and Deterin或CG24）。 我們分析了推定基因06，24和9與幾種生物體中其他BIR結構域的系統發育關系。推定基因24中的BIR結構域與黑虎蝦IAP基因中的BIR結構域聚集在一起，表明推定基因25可能與黑虎蝦IAP具有相同的功能。
特别令人感興趣的是，推定基因22包含五個BIR結構域，這是第一份關于包含三個以上BIR結構域的BIRP的報告。已知BIR結構域在蛋白質-蛋白質互相作用中起重要作用，并且已經表明，單個蛋白質分子中存在多個BIR結構域增加了BIRP對目标蛋白質的親和力。
此外，BIRP可以互相作用的目标分子範圍也随着BIR結構域的數量而增加。是以，具有五個BIR結構域的推定基因<>可能是一種具有不同功能的新型BIRP。
結論
我們的結果表明，大DNA片段的超擴增發生在kuruma蝦基因組中。雖然我們隻分析了部分重複的DNA片段，但我們的結果表明，按照正常的分析方法很難分析蝦基因組。是以，在研究蝦基因組中的其他獨特結構時，有必要避免重複序列。
參考文獻
- Rees DJ，Dufresne F，Glémet H，Belzile C：片腳類動物基因組大小：北極物種的首次估計揭示了基因組巨人。基因組。2007, 50: 151-158.10.1139/G06-155.
- Rheinsmith EL，Hinegardner R，Bachmann K：甲殼類動物中的核DNA含量。比較生化生理學B. 1974， 15： 343-348.10.1016/0305-0491(74)90269-7.
- Vaughn JC，Traeger FJ：甲殼類中重複DNA堿基序列的保守：十足類系統發育的分子方法。J 摩爾·埃沃爾。1976, 29: 111-131.10.1007/BF01732470.
- Christie NT，Skinner DM：真核生物高度重複DNA的一部分非随機改變的證據。核酸研究 1980， 25： 279-298.10.1093/nar/8.2.279。